【摘 要】
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背景与目的：5-羟色胺5A受体是5-羟色胺受体家族中的一个亚型，是主要定位于中枢神经系统的一种G蛋白偶联受体。在对小鼠、大鼠和人mRNA的定位研究显示5-HT5A受体mRNA在脑组织中广泛表达，但在外周组织的表达很低甚至不表达。5-HT5A受体的分布区域与认知、焦虑的调节、感觉的形成、神经内分泌、运动的整合、昼夜节律的调节及疼痛的调控有关。虽然5-HT5A受体被发现已经超过10年，但是目前国内外少
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背景与目的：
5-羟色胺5A受体是5-羟色胺受体家族中的一个亚型，是主要定位于中枢神经系统的一种G蛋白偶联受体。在对小鼠、大鼠和人mRNA的定位研究显示5-HT5A受体mRNA在脑组织中广泛表达，但在外周组织的表达很低甚至不表达。5-HT5A受体的分布区域与认知、焦虑的调节、感觉的形成、神经内分泌、运动的整合、昼夜节律的调节及疼痛的调控有关。虽然5-HT5A受体被发现已经超过10年，但是目前国内外少有对5-HT5A受体功能的深入研究。这主要是因为缺乏针对5-HT5A受体的高选择性配体和拮抗剂，因此很难界定5-HT5A受体在生理和病理过程中所发挥的作用。因此本实验构建了以5-HT5A受体基因为靶标的siRNA表达载体，并观察其在大鼠神经细胞中的表达，为在动物体内进一步研究该受体的功能提供了技术支持。
研究方法：
1.设计并构建了针对5-HT5A受体mRNA的3条siRNA质粒表达载体pGenesil-2 Htr5al、pGenesil-2 Htr5a2、pGenesil-2 Htr5a3和一条无关对照序列表达载体pGenesil-2 HK，同时还构建了一条携带有5-HT5A受体全长基因并同时表达红色和绿色荧光蛋白的质粒表达载体pDsRed-EGFP-Htr5a。分别将pGenesil-2 Htr5al、pGenesil-2 Htr5a2、pGenesil-2 Htr5a3、pGenesil-2 HK质粒表达载体与pDsRed-EGFP-Htr5a质粒表达载体共转染293细胞，48小时后进行流式细胞筛选，通过用Red红色荧光做对照，EGFP绿色荧光为主要荧光，看干扰序列对EGFP的减弱程度，从而鉴定出相应的干扰序列对基因的干扰效果，对EGFP减弱程度越明显，说明干扰效果越明显。
2.将筛选出的pGenesil-2 Htr5a2表达载体中的Htr5a2表达框亚克隆至pGenesil1.2构建pGenesil1.2 Htr5a2质粒表达载体，然后将pGenesil1.2 Htr5a2与pGSadeno腺病毒表达载体进行同源重组，构建pGSadeno Htr5a2重组腺病毒表达载体，将其转染293细胞进行包装出毒并进一步放大培养以获得需要的病毒量。将收获的pGSadeno Htr5a2重组腺病毒转染原代培养的大鼠神经细胞，48小时后用RT-PCR技术检测各组神经细胞内5-HT5A受体mRNA的表达情况。
结果：
1.经酶切鉴定及DNA测序，重组质粒中已插入了目的基因片段。经流式细胞检测，通过比较GFP平均荧光强度与RFP平均荧光强度的比值，就能筛选出最有效的序列。其中pGenesil-2 Htr5a2的GFP平均荧光强度/RFP平均荧光强度的值为0.39，pGenesil-2 Htr5al的值为0.539，pGenesil-2 Htr5a3的值为0.417，pGenesil-2 HK的值为1.626，由此可知pGenesil-2 Htr5a2能有效抑制5-HT5A受体基因的表达。
2.通过酶切鉴定，证明了目的基因片段正确插入了pGSadeno腺病毒载体中。由于pGSadeno Htr5a2重组腺病毒中有绿色荧光蛋白真核表达框，因此在转染细胞后如果出现明显的绿色荧光蛋白表达，则说明有感染能力的重组腺病毒包装成功，而且经测定腺病毒滴度达到109 pfu/ml。将pGSadeno Htr5a2重组腺病毒转染神经细胞后24小时可以观察到绿色荧光蛋白的表达，48小时后经RT-PCR技术检测pGSadeno Htr5a2重组腺病毒能有效抑制5-HT5A受体mRNA的表达。
结论：
1.成功构建了和鉴定了针对5-HT5A受体基因的RNA干扰重组质粒表达载体pGenesil-2 Htr5al、pGenesil-2 Htr5a2、pGenesil-2 Htr5a3，并发现pGenesil2-Htr5a2能有效抑制外源性5-HT5A受体基因在293细胞中的表达，从而筛选出最有效的重组质粒表达载体，为下一步构建针对5-HT5A受体基因的siRNA重组腺病毒表达载体做好了准备。
2.成功构建了和鉴定了针对5-HT5A受体基因的siRNA重组腺病毒表达载体pGSadeno Htr5a2，将其包装出毒，并且验证了pGSadeno Htr5a2重组腺病毒能有效抑制内源性5-HT5A受体基因在神经细胞中的表达，为以后的动物试验提供了技术支持。
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