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研究背景脊髓背角神经元突触可塑性改变是参与神经病理性疼痛痛觉信息传递和维持的重要机制。多种免疫趋化因子、神经递质、神经多肽和信号转导因子协同作用参与调节脊髓背角神经元的突触可塑性改变,组成脊髓背角对痛觉信息调控的机制网络。其中脊髓背角泛素-蛋白酶体系统中多种组分通过泛素化降解不同底物蛋白,参与调控慢性疼痛的发展和维持。细胞周期末期促进复合物(anaphase-promoting complex,APC)为泛素-蛋白酶体系统中一 E3泛素连接酶,广泛存在于增殖期的真核细胞和终分化的神经元中。APC自身活化和功能维持需要其调节亚基Cdh1或Cdc20的存在。近年来,多项研究显示APC-Cdh1参与神经元突触发育形成与突触传递。基于APC-Cdh1在神经系统中的重要作用,其表达和活性异常也与多种神经系统病理状态密切相关,如缺血性脑损伤与阿尔兹海默病。有趣的是,最近的研究报道外周神经损伤引起前扣带回皮层APC-Cdh1活性下调,APC-Cdh1参与调控神经病理性疼痛大鼠前扣带回皮层神经元凋亡。但作为痛觉信息传递初级中枢的脊髓背角,神经病理性疼痛状态下APC-Cdh1在其中的作用尚不可知。本研究拟通过构建大鼠外周神经损伤诱导的神经病理性疼痛模型,采用行为学、分子生物学、形态学和基因调控技术,以脊髓背角为切入点,评价APC-Cdh1在神经病理性疼痛痛觉超敏反应发展和维持中的作用及其相关机制。方法与结果第一部分外周神经损伤引起脊髓背角APC-Cdh1信号通路分子的表达变化方法:构建大鼠坐骨神经保留性损伤(spared nerve injury,SNI)模型诱导大鼠神经病理性疼痛的形成。SNI术后1、3、7、14 d观察大鼠双侧后足底外侧端50%机械刺激反应阈值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)变化。采用免疫组化方法检测SNI术后7 d大鼠双侧脊髓背角c-Fos蛋白表达变化。采用Western-Blot方法检测SNI术后14 d大鼠双侧脊髓背角APC-Cdh1、其上游调节蛋白Cdk5与p35、其下游底物蛋白Skp2与SnoN总蛋白表达改变。结果:SNI术后3 d大鼠术侧后足外侧端50%PWMT开始下降,可稳定持续至术后14 d,于术后7 d达最低值,显示SNI可稳定诱导出大鼠痛觉超敏反应。SNI术后7 d大鼠术侧脊髓背角中c-Fos免疫阳性细胞数量显著增加,且主要集中在脊髓背角浅层,显示SNI诱导大鼠脊髓背角神经元活化。SNI术后14 d大鼠术侧脊髓背角中Cdh1总蛋白表达下调而p35总蛋白表达上调,提示SNI引起脊髓背角APC-Cdh1信号通路活性下调。第二部分脊髓背角Cdh1分子在外周神经损伤引起的痛觉超敏反应中的作用方法:通过免疫荧光双标方法检测Cdh1在大鼠脊髓背角中的分布与表达特点。构建大鼠SNI神经病理性疼痛,通过免疫荧光和Western-Blot方法检测SNI术后14 d大鼠术侧脊髓背角中Cdh1胞浆蛋白的表达变化。大鼠鞘内置管并给以介导Cdh1过表达的慢病毒(Lenti-Cdh1-GFP)、对照慢病毒(Lenti-GFP)或生理盐水,给药后3d通过免疫荧光检测大鼠脊髓背角中GFP表达,通过Western-Blot检测Cdh1总蛋白表达改变。大鼠鞘内置管后行SNI手术,并于SNI术后7 d鞘内给以Lenti-Cdh1-GFP、Lenti-GFP或生理盐水,给药后1、3、7、14 d观察大鼠术侧后足外侧端50%PWMT变化。结果:在大鼠脊髓背角中,Cdh1主要表达于NeuN标记的神经元中,而GFAP标记的星形胶质细胞中未见其表达。SNI术后14 d大鼠术侧脊髓背角中Cdh1胞浆蛋白表达上调,部分Cdh1由胞核表达转变为胞浆表达。大鼠鞘内给药后3d,Lenti-Cdh1-GFP组与Lenti-GFP组大鼠脊髓背角中可见大量GFP免疫阳性细胞,Lenti-Cdh1-GFP组大鼠脊髓背角中Cdh1蛋白表达显著增高,且可见Cdh1-GFP融合蛋白,显示Cdh1过表达的慢病毒成功转染大鼠脊髓背角。鞘内给以Lenti-Cdh1-GFP后7 d SNI大鼠术侧后足外侧端50%PWMT开始增高,并稳定持续于给药后14d,显示鞘内给以Cdh1过表达的慢病毒可有效缓解SNI诱导的大鼠痛觉超敏反应。第三部分APC-Cdh1对神经病理性疼痛大鼠脊髓背角突触结构与AMPA受体运输及功能的影响方法:构建大鼠SNI神经病理性疼痛模型,SNI术后7 d鞘内给以Lenti-Cdh1-GFP、Lenti-GFP或生理盐水,鞘内给药后14 d通过透射电镜观察Cdh1活性调节对SNI大鼠脊髓背角突触超微结构的影响。通过Western-Blot方法检测SNI术后14 d大鼠双侧脊髓背角中AMPA受体GluRI亚基胞浆蛋白与胞膜蛋白、Cdh1相关的EphA4-EphrinA1通路蛋白的表达变化。通过免疫共沉淀方法检测SNI术后14 d脊髓背角中GluR1与APC2、Cdh1、EphA4-EphrinA1的相互作用。SNI术后7d鞘内给以Lenti-Cdh1-GFP、Lenti-GFP或生理盐水,鞘内给药后14 d通过Western-Blot检测术侧脊髓背角GluR1、EphA4-EphrinA1蛋白的表达变化。结果:鞘内给以Lenti-Cdh1-GFP后14 d SNI大鼠术侧脊髓背角神经元兴奋性突触的超微结构趋向于Sham组形态。SNI术后14 d大鼠术侧脊髓背角GluR1膜蛋白表达上调而胞浆蛋白表达下调,EphA4-EphrinA1表达下调,且GluR1与Cdh1、EphA4-EphrinA1存在相互作用。鞘内给以Lenti-Cdh1-GFP后14 d,与SNI + Lenti-GFP和SNI +生理盐水组相比,SNI + Lenti-Cdh1-GFP组大鼠术侧脊髓背角的GluR1膜蛋白表达下调,而EphA4-EphrinA1表达上调。结论1.SNI诱导大鼠术侧脊髓背角Cdh1总蛋白表达和活性下调。2.脊髓背角Cdh1活性下调参与SNI诱导的大鼠痛觉超敏反应的发展和维持。3.脊髓背角Cdh1可能通过与EphA4-EphrinA1相互作用参与下调含有GluR1亚基的AMPA受体的向膜转运,参与神经病理性疼痛过程。