对萼猕猴桃对淹水胁迫的响应机制及耐涝基因AvERF078的功能分析

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猕猴桃属于落叶果树,原产于中国。我国猕猴桃的种植面积居世界首位。因为猕猴桃根系多为肉质根,所以其对淹水胁迫敏感,积水数天便易导致树体死亡。将猕猴桃的接穗品种嫁接到耐涝砧木上,一定程度上能够降低涝害对生产的影响。生产上常以美味猕猴桃的实生苗作为砧木,但这类砧木的耐涝性仍较差。近些年的研究发现,对萼猕猴桃的耐涝性显著强于美味猕猴桃。本文首先通过比较三个对萼猕猴桃基因型在淹水胁迫和淹水胁迫解除后的生理响应,筛选出耐涝优系KR5。然后,对KR5和美味猕猴桃‘海沃德’(淹水敏感型)进行淹水处理,观察植株形态,测定厌氧发酵酶的活力和相关代谢物的含量,取根系组织进行转录组测序,旨在探索两种材料响应淹水胁迫的差异。另外,从KR5中克隆了候选耐涝基因AvERF078,并利用农杆菌介导的遗传转化方法将该基因转入‘红阳’猕猴桃(淹水敏感型),验证该基因的功能,解析猕猴桃的耐涝机理。本研究的主要结果如下:1.三个对萼猕猴桃基因型中,KR5是最优异的耐涝资源。淹水胁迫导致三个基因型的新梢生长量、鲜重、相对含水量和净光合速率均降低。淹水胁迫下,与KR1和KR3相比,KR5维持新梢生长和地上部含水量的能力更强。淹水7 d后,三个基因型根系的可溶性总糖含量均增加,但KR5的含量最高;淹水28 d后,三个基因型中,KR5根系形态受害的程度最小;淹水58 d后,KR3和KR5的死亡率均低于KR1。淹水7 d至28 d后再恢复,三个基因型的新梢生长量、鲜重和相对含水量均能得到不同程度的恢复,但KR5的恢复程度好于其他两个基因型。2.与美味猕猴桃‘海沃德’相比,KR5更能通过形态和生理代谢变化适应淹水胁迫。淹水胁迫下,‘海沃德’植株地上部受害程度更重,相对含水量和净光合速率下降更快,叶片的丙二醛含量更高,根系和根颈部更容易发褐、腐烂,而KR5植株更健康,并能在根颈部形成肥大的皮孔和不定根;‘海沃德’根系面临蔗糖含量不足,乳酸和乙醇等产物过度积累的问题,而KR5根系能够积累蔗糖,并将乳酸和乙醇的含量控制在较低水平;KR5根系水解氨基酸的总量比‘海沃德’的更高。3.淹水胁迫下,KR5和‘海沃德’在转录调控根系的糖代谢、氮素同化和糖酵解等方面存在差异。淹水72 h后,两基因型差异表达基因(DEGs)的数目均达到最大。对淹水72 h后的DEGs进行GO富集分析发现,KR5的DEGs主要富集在糖代谢和蛋白质磷酸化等生物进程,而‘海沃德’的DEGs主要富集在糖代谢和氮代谢等生物进程。淹水72 h后,多数β-淀粉酶基因的表达量在KR5根系增加,而在‘海沃德’根系降低;硝酸还原酶基因的表达量仅在KR5的根系增加;铵态氮含量在两个基因型的根系均增加,但在KR5的增幅更大;在两个基因型的根系,焦磷酸依赖性磷酸果糖激酶(PFP)基因的表达量均增加但PFP活力均降低。淹水胁迫下,乙烯受体(ETR3)和聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(SRO2)等直系同源基因在KR5根系的表达量增幅比在‘海沃德’根系更高。4.AvERF078转基因株系的耐涝性显著强于对照株系。淹水胁迫下,AvERF078基因的表达量在KR5根系显著增加。拟南芥原生质体瞬时转化试验表明,AvERF078定位在细胞核中。转录活性分析表明,该基因具有转录活性。通过农杆菌介导的遗传转化,将AvERF078基因转入中华猕猴桃‘红阳’中,获得转基因株系。淹水12 h后,与对照株系相比,Ac ERF74、Ad RAP2.3、Ac PDC2和Ad PDC1等基因的表达量和蔗糖、果糖、葡萄糖及丙氨酸等代谢物的含量在转基因株系中均升高。淹水14 d后,与对照株系相比,两个转基因株系的死亡率显著降低、地上部的鲜重和干重均显著增加。启动子元件分析发现,AvERF078的启动子上存在低氧响应和激素响应的元件。酵母双杂交试验发现,AvERF078与热激蛋白AvHSP1存在互作关系。
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