论文部分内容阅读
本研究以小鼠乳腺上皮细胞系(EpH4-Ev)、小鼠免疫细胞(T淋巴细胞、嗜中性粒细胞)及乳房链球菌01401(Sterptococcus uberis 0140J,S.uberis 0140J)为研究对象,利用S.uberis 0140J与EpH4-Ev、小鼠免疫细胞共孵育模型,探讨乳房链球菌感染对小鼠乳腺及系统防御细胞引起的炎症损伤;在此基础上,揭示牛磺酸对损伤的缓解作用及机制。结果如下:1牛磺酸对乳房链球菌侵染乳腺上皮细胞造成的炎性变化的缓解作用为探讨S uberis感染乳腺上皮细胞后产生的炎症变化及牛磺酸对炎性变化的缓解作用,本研究以EpH4-Ev细胞和S.uberis 0140J为研究对象,首先检测Z.uberis 0140J与EpH4-Ev细胞共孵育后EpH4-Ev细胞产生的炎性变化;在此基础上探究牛磺酸对S.uberis 0140J粘附、内化到EpH4-Ev细胞及造成的炎性损伤的影响。研究结果发现:S.uberis 0140J能够粘附、内化到EpH4-Ev细胞,牛磺酸处理对粘附、内化有一定的降低作用,但不同浓度牛磺酸之间均无统计学上的显著性变化。S.ueris0140J感染EpH4-Ev细胞2 h后肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)mRNA 表达水平及细胞上清液中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase,NAGase)的活性显著提高(P<0.01);4h后乳铁蛋白(lactoferrin,LF)mRNA表达水平显著上升(P<0.01)。15mmoI/L、45mmol/L牛磺酸预处理EpH4-Ev细胞能显著降低 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 mRNA 的表达水平(P<0.01),5 mmol/L、15 mmol/L 牛磺酸处理EpH4-Ev细胞能显著降低细胞上清液中NAGase的活性(P<0.01)。研究结果表明:牛磺酸可以减弱因S.uberis 0140J感染而引起的EpH4-Ev细胞的炎性变化,该作用可能与其降低S.uberis0140J对EpH4-Ev细胞的粘附、内化有关。2 TLR-2/Ca2+介导的炎症通路在牛磺酸抗乳房链球菌感染过程中的作用为探讨Ca2+介导的炎症通路在牛磺酸抗乳房链球菌感染过程中的作用,本研究以EpH4-Ev和S.uberis 0140J为研究对象,首先,检测了 S uberis0140J与EpH4-Ev细胞共孵育后EpH4-Ev细胞Toll样受体-2(TLR-2)蛋白的表达;流式检测了 EpH4-Ev细胞内Ca2+浓度水平的变化;其次,利用酶联免疫吸附试验和凝胶迁移试验分别检测Ca2+相关蛋白的含量和核转录因子活性变化;最后,通过加入抑制剂,利用蛋白芯片检测下游相关炎症因子分泌的变化;在此基础上探究牛磺酸对Ca2+介导的炎症通路的影响。研究结果发现:S.uberis0140J感染EpH4-Ev细胞3 h后,EpH4-Ev细胞Toll样受体-2(TLR-2)蛋白表达显著升高(P<0.01),而预处理牛磺酸可以显著性的降低TLR-2蛋白的表达;/S.uberis 0140J能够引起细胞内Ca2+浓度水平显著性增加(P<0.01),预处理牛磺酸可以显著性的降低EpH4-Ev细胞内Ca2+浓度;S.uberis 0140J感染EpH4-Ev细胞3 h后,EpH4-Ev细胞PKC-α PLC-γ1蛋白含量均显著性升高(P<0.01),而预处理牛磺酸可以显著性的降低EpH4-Ev细胞PKC-α、PLC-y1的蛋白含量(P<0.0S);S.ubeis 0140J 感染 EpH4-Ev 细胞 3 h 后,核转录因子 NF-kB、NFAT活性极显著性升高(P<0.01),预处理牛磺酸对两者活性有显著性的降低作用(P<0.05);S.uberis 0140J感染EpH4-Ev细胞3 h后,细胞上清液中的G-CSF、IL-6和MCP-1荧光强度均极显著性升高(P<0.01);IL-2、TNF-α、IL-1β、KC、FasL、LIX荧光强度显著性升高(P<0.05);IL-15荧光强度无统计学上的显著性变化;预处理牛磺酸可以极显著性的降低IL-6的荧光强度(P<0.01);同时,能显著性的降低IL-2、TNF-α、IL-1β、KC、MCP-1的荧光强度(P<0.05)。研究结果表明:牛磺酸可以降低因S.uberis 0140J感染而引起的EpH4-Ev细胞TLR-2蛋白的表达、细胞内Ca2+浓度水平的升高及与Ca2+相关蛋白、核转录因子活性和下游相关炎症因子的分泌。说明牛磺酸抗乳房链球菌感染的机制与TLR-2/Ca2+介导的炎症通路密切相关。3 TLR-2在牛磺酸影响乳房链球菌侵染造成的小鼠免疫细胞胞浆Ca2+变化中的作用为探讨TLR-2在牛磺酸影响乳房链球菌侵染造成的小鼠免疫细胞胞浆Ca2+变化中的作用。本研究以正常B6和TLR-2基因缺失小鼠血液中的T淋巴细胞、嗜中性粒细胞为研究对象,利用流式细胞术检测S uberis 0140J与T淋巴细胞和嗜中性粒细胞共孵育后免疫细胞内Ca2+浓度水平的变化。研究结果发现:在正常小鼠中,S:uberis 0140J能够引起T淋巴细胞及嗜中性粒细胞内Ca2+浓度水平显著性增加(P<0.01);牛磺酸预处理可以显著性的降低T淋巴细胞内Ca2+浓度水平(P<0.01),但嗜中性粒细胞预处理牛磺酸后平均荧光强度较S.utberis 组相比无统计学上的显著性差异。在TLR-2基因缺失小鼠中,S uberis 0140J能够引起T淋巴细胞内Ca2+浓度水平显著性增力加(P<0.05);牛磺酸预处理可以显著性的降低T淋巴细胞内Ca2+浓度水平(P<0.01);但对于TLR-2基因缺失的嗜中性粒细胞,各组之间没有统计学上的显著性差异。研究结果表明:牛磺酸可以降低因&uberis 0140J感染而引起的正常B6和TLR-2基因缺失小鼠免疫细胞内Ca2+浓度水平的升高,并且与正常B6小鼠相比,TLR-2基因缺失小鼠免疫细胞内Ca2+浓度水平基准程度明显降低,说明免疫细胞内Ca2+浓度的升高与TLR-2受体识别S.wberis密切相关。