细胞程序性坏死(programmed necrosis,necroptosis)是近年来鉴定的一种新的细胞程序性死亡方式,在炎症反应、外源微生物入侵防御和胚胎发育等病理和生理过程中都发挥着重要调控作用。多种因素都能够诱导细胞程序性坏死,其中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor alpha,TNFα)诱导的细胞程序性坏死目前研究的最为广泛。TNFα是一种多功能的细胞因子,与细胞膜上的受体(TNFαreceptor 1,TNFR1)结合后促进TNFR1胞内段构象发生改变,进而招募并结合具有死亡结构域的接头蛋白,如TRADD(TNF receptor 1 associated death domain)和RIP1(receptor-interacting protein 1),形成复合体I(complex I),进而招募其他蛋白激酶,活化NFκB或MAPK信号通路,促进细胞生存和增殖。RIP1与TNFR1解离后进入细胞质,招募并结合RIP3(receptor-interacting protein 3),形成”坏死复合体(necrosome)”,且两者通过相互磷酸化或在其他蛋白的影响下磷酸化而激活,进而招募并结合RIP3的底物蛋白MLKL(mixed lineage kinase domain like pseudokinase),促进MLKL的磷酸化与多聚化,并转移到细胞膜上与磷脂酰肌醇相结合,破坏细胞膜的结构,导致细胞程序性坏死。RIP1是首个鉴定的细胞程序性坏死调控蛋白,其别构抑制剂Necrostatin-1在细胞和疾病模型中都能显著抑制细胞程序性坏死的发生。同时,敲低RIP1也能显著抑制TNFα与Z-VAD联合诱导的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast,MEF)、3T3(过表达RIP3)和HT29等细胞的程序性坏死,表明RIP1是启动细胞程序性坏死的必不可少的靶蛋白。但是,近期研究发现敲低L929细胞内的RIP1,并不抑制TNFα单独或与Z-VAD联合诱导的细胞死亡,且这一现象在MEF细胞中得到进一步验证,表明在敲低RIP1的L929或MEF细胞中TNFα可以通过其他机制来诱导细胞死亡,但这种细胞死亡的类型、调控靶点与机制目前并不清楚。本研究以l929细胞为模型,利用慢病毒介导的rna干涉技术构建了稳定敲低rip1及其他靶蛋白的l929细胞株,探索了tnfα诱导rip1非依赖性细胞死亡的调控靶点与机制。我们发现rip1敲低并不抑制tnfα诱导的细胞死亡,且细胞凋亡抑制剂z-vad-fmk及caspase8敲低对细胞死亡过程中没有抑制作用,表明rip1非依赖的细胞死亡不是凋亡,而是程序性坏死。同时,tnfα在诱导rip1非依赖的细胞程序性坏死促进rip3及其底物蛋白mlkl的磷酸化和多聚化,且敲低rip3或mlkl能够阻断rip1非依赖的细胞程序性坏死,表明tnfα通过活化rip3/mlkl信号通路来诱导rip1非依赖的细胞程序性坏死。rip1可以通过结合tnfr1与rip3来形成不同的蛋白复合体,进而促进细胞程序性坏死信号从tnfr1传递到rip3,但目前并无rip3与tnfr1直接结合的相关报道,因此,在敲低rip1的细胞中tnfα诱导的细胞程序性坏死信号如何从tnfr1传递到rip3目前并不清楚。本研究发现rip1敲低促进rip3与tnfr1的结合,以及rip3与tradd的相互结合,但tradd敲低则阻断rip3与tnfr1结合形成的蛋白复合体,表明tradd能够介导rip3与tnfr1的结合,进而促进细胞程序性坏死信号的传递。同时,我们发现敲低tradd能够完全抑制tnfα诱导的rip1非依赖的细胞程序性坏死,以及rip3/mlkl信号通路的活化,表明tradd通过介导细胞程序性坏死信号的传递来启动tnfα诱导的rip1非依赖的细胞程序性坏死。此外,我们发现敲低rip3能抑制tnfα与z-vad联合诱导的细胞死亡,但并不阻断tnfα单独诱导的细胞死亡,表明rip3敲低可导致tnfα诱导的细胞死亡方式由程序性坏死转变为细胞凋亡。同时,在rip3非依赖的细胞死亡过程中检测到caspase信号通路的活化,且敲低caspase8能完全阻断rip3非依赖的细胞死亡,进一步验证了rip3非依赖的细胞死亡是细胞凋亡。由于敲低tradd能够显著抑制rip3非依赖的细胞凋亡,且tradd在细胞凋亡过程中能结合caspase8并促进其活化,进而激活caspase信号通路,表明tradd也是调控rip3非依赖的细胞凋亡的重要靶点,并通过活化caspase信号通路来启动细胞凋亡。因此,本研究发现tradd是RIP1非依赖的细胞程序性坏死的调控靶点,也是启动RIP3非依赖的细胞凋亡的重要靶蛋白,分别通过活化RIP3/MLK信号通路和caspase信号通路来启动RIP1非依赖的细胞程序性坏死和RIP3非依赖的细胞凋亡,从而系统阐述了TRADD、RIP1和RIP3在TNFα诱导细胞程序性死亡过程中的相互补充和相互调节作用,进一步揭示了细胞程序性死亡的调控靶点,阐明了细胞程序性坏死的调控机制。