鸡传染性支气管炎病毒RT-PCR检测方法建立及非结构蛋白nsp15单克隆抗体的制备

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根据GenBank上400多株IBV病毒的S1基因序列设计特异性RT-PCR引物扩增S1基因从91位碱基至303位碱基的213bp的保守区域。对该引物的PCR程序进行引物浓度、退火温度、延伸时间、PCR循环数等条件设置梯度进行对比并优化,建立RT-PCR检测方法。建立的RT-PCR方法可以特异性检测不同组织嗜性IBV毒株,不能检测包括FPV、NDV、IBDV、H1N1、H9N2等在内的其他禽类病毒核酸以及IBV自身除S基因外的部分结构蛋白基因和非结构蛋白基因(包括M基因、N基因、E基因、nsp2基因、nsp5基因、nsp15基因等)。灵敏性测定结果显示,通用型RT-PCR检测方法的检测下限为1.5ng cDNA/μl。用建立的RT-PCR方法进行临床样品的检测,在攻毒第二天即可从IBV感染的SPF鸡肛咽拭子中,以及组织病料中检测到病毒核酸。   以IBV肾型毒株SC021202为模版扩增1014bp的IBV非结构蛋白nsp15基因,构建了原核表达载体PET-28a-nsp15。经IPTG诱导,在大肠杆菌中成功表达出约45kDa的目的蛋白。表达的蛋白能与抗His的单克隆抗体反应。纯化的nsp15重组蛋白作为ELISA检测抗原,与肾型毒株、腺胃型毒株、呼吸型毒株制备的高免血清有反应性。纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞进行筛选,经三次有限稀释法克隆,获得了3株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1A6、2B6和4D7。Western blot分析显示三株单克隆抗体都与nsp15蛋白有较好的特异性反应。IFA检测显示3株单克隆抗体与不同组织嗜性毒株的细胞适应毒均具有较好的反应性。IBV nsp15单克隆抗体的制备为传染性支气管炎病毒的监测和鉴别以及对其蛋白的进一步研究奠定了基础。  
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