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全身麻醉可被定义为一种遗忘、镇静、制动、镇痛以及意识消失等可逆性的药理学状态。世界卫生组织(WHO)的调查结果显示2007年全球手术量高达2.34亿例，其中大多数手术需要在全麻下进行，目前我国每年麻醉例数已达6000万居世界首位。尽管越来越多的患者因为外科手术或有创诊疗需要接受全身麻醉，然而全麻药物是如何导致意识消失以及又是如何从全麻中恢复意识的具体机制至今仍是自然科学未解之谜。麻醉诱导和苏醒与自然睡眠和觉醒在某种程度上有相似之处。目前，不少研究通过干预睡眠或觉醒相关的某个特定的功能核团或某种特定类型神经元来研究全身麻醉的机制，例如，异氟烷全身麻醉下，通过光遗传学手段特异性激活腹侧被盖区(ventral tegmental area, VTA)多巴胺能神经元可以使小鼠出现觉醒反应；靶向毁损大鼠基底前脑(basal forebrain, BF)胆碱能神经元可缩短全麻诱导时间，延迟全麻的苏醒等等，然而以自然睡眠觉醒调控的神经环路为切入点，观察调控自然睡眠觉醒的外界环境因素，是否影响全麻诱导、维持和苏醒的研究目前为数不多。
单色蓝光(monochromatic blue light, MBL)的波长在400nm~490nm之间，对生物机体既有利也有害。其中415~455nm之间的蓝光波长短、能量高，可直接穿透晶状体到达眼底的视网膜，从而导致视网膜细胞发生衰亡，此波段的蓝光是有害蓝光；波段在455nm~490nm的蓝光，有调整生物节律的作用，睡眠-觉醒、认知、情绪、记忆力等都与其密切相关，此波段的蓝光是有益蓝光。固有的自主感光性视网膜神经节细胞(intrinsically photosensitive retinal ganglion cells, ipRGCs)对波长在460~480nm之间的蓝光特别敏感，在蓝光参与调节睡眠-觉醒中发挥了重要作用。动物研究表明，470nm的蓝光通过ipRGCs表达的M1型黑视蛋白增加觉醒时间。临床研究表明，晚上暴露于460nm的单色蓝光2小时，在第一个睡眠周期可有效降低慢波活动(slow wave activity，SWA:0.75–4.5 Hz)，而在第三个睡眠周期时可以增加前额的SWA，并在第一个和第三个睡眠周期均可缩短快速眼动睡眠(rapid eye movement sleep，REMS)时间。越来越多的研究表明全身麻醉与睡眠-觉醒有部分共同的神经环路机制，调控调节睡眠-觉醒的某些特定核团或者神经递质，可影响全麻的全身作用。麻醉药物也可以作用于睡眠中枢，如丙泊酚麻醉接近自然睡眠的状态，可产生类似于非快速眼动睡眠(non-rapid eye movement sleep，NREMS)的脑电图(electroencephalogram, EEG)，但单色蓝光是否影响全身麻醉尚不清楚。
哺乳动物下丘脑视交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)是机体主要的中枢神经系统昼夜节律起搏点，调控着包括睡眠-觉醒在内的24小时生物节律。光作为最有效的环境刺激之一，在哺乳动物中具有视觉图像形成和非视觉图像形成(non-image-forming, NIF)功能。光通过表达在ipRGCs上的黑视蛋白直接或者间接影响NIF功能。其中ipRGCs投射到SCN发挥包括同步昼夜节律生物钟，抑制松果体褪黑素分泌，调节瞳孔对光反射，改变睡眠和觉醒，影响情绪和认知等不同作用。最新的研究表明，蓝光使得小鼠SCN的FosmRNA的表达增加，导致肾上腺自主神经支配的皮质酮升高，从而增加小鼠的觉醒行为。此外，SCN作为光调节睡眠-觉醒的信息整合中枢，将单突触和多突触连接投射到与睡眠-觉醒相关的下丘脑内，从而影响睡眠和觉醒。研究表明SCN向下丘脑背内侧核(dorsomedial hypothalamus，DMH)有密集的投射，DMH将抑制性的γ-氨基丁酸能神经纤维投射至腹外侧视前核(ventrolateral preoptic nucleus， VLPO)，将兴奋性的谷氨酸能神经纤维投射至外侧下丘(lateral hypothalamus，LH)。此外，SCN也可通过DMH投射到蓝斑(locus coeruleus，LC)，从而兴奋睡眠-觉醒网络中的促觉醒神经元以及大脑皮层发挥促觉醒作用。Pilorz等人的研究表明环境蓝光通过激活SCN对C57BL/6小鼠发挥促觉醒作用，而环境绿光通过兴奋VLPO则表现出相反的效应，即促睡眠作用。因此单色蓝光是否通过SCN以及SCN下游核团影响七氟烷麻醉诱导、维持和苏醒目前尚不明确。
为探讨单色环境蓝光对七氟烷麻醉的影响及其机制，我们测量了翻正反射消失(loss of righting reflex, LORR)时间与翻正反射恢复(recovery of righting reflex, RORR)时间，以观察单色蓝光对七氟烷麻醉诱导和苏醒的影响。然后，通过记录皮层脑电图(electroencephalogram, EEG)和肌电图(electromyogram, EMG)监测七氟烷麻醉下的爆发抑制，计算EEG爆发抑制率(burst-suppression ratio，BSR)和EEG频谱能量，以评估七氟烷麻醉下单色蓝光对爆发抑制的影响。采用免疫荧光染色和局部场电位(local field potential，LFP)记录来观察七氟烷麻醉下单色蓝光对SCN神经元活性的影响。通过对小鼠双侧SCN核团的局部电毁损建立SCN毁损模型，采用行为学、EEG–EMG监测进一步证实SCN参与了单色蓝光对七氟烷麻醉的促觉醒作用。最后，我们采用免疫荧光染色观察在七氟烷麻醉下SCN典型投射区c-Fos的表达，探讨其下游的可能机制。
研究方法与结果
第一部分单色蓝光对七氟烷麻醉诱导和苏醒的影响
方法：采用雄性C57BL/6J(C57)小鼠(10-12周龄,体重22-26g)作为研究对象，所有实验都是在白天(8:00 am-5:00 pm)进行。
1.观察单色蓝光对七氟烷麻醉诱导的影响：在七氟烷麻醉开始前，将C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内适应30min并暴露在室内环境光下，当开始1MAC七氟烷麻醉的同时，在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800lux的多色白光(polychromatic white light, PWL)或者单色蓝光(monochromatic blue light, MBL)(460 nm),待小鼠翻正反射消失时，观察记录PWL或者MBL对小鼠LORR时间的影响。
2.观察单色蓝光对七氟烷麻醉苏醒的影响：将C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内维持1MAC七氟烷麻醉30min并暴露在室内环境光下，当停止七氟烷麻醉的同时，在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800lux的PWL或者MBL(460 nm)，待小鼠翻正反射恢复时，观察记录PWL或者MBL对小鼠RORR时间的影响。
3.观察单色蓝光在七氟烷麻醉苏醒时对EEG的影响：将置了EEG-EMG电极的C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内维持1MAC七氟烷麻醉30min并暴露在室内环境光下，当停止七氟烷麻醉的同时，在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800lux的PWL或者MBL(460 nm)。从开始麻醉，全程记录小鼠的脑电和肌电，直至小鼠意识完全恢复，出现体动后停止记录。
结果：
1.在七氟烷麻醉诱导过程中，与PWL组(181.1s±10.60)相比，MBL组(176.0s±7.976)小鼠七氟烷麻醉诱导翻正反射消失的时间没有显著差异。
2.在七氟烷麻醉苏醒过程中，与PWL组(133.1s±13.53)相比，MBL组(38.75s±5.291)小鼠七氟烷麻醉苏醒翻正反射恢复的时间显著缩短(p＜0.001)。
3.脑电分析结果表明，在七氟烷麻醉苏醒期间，与PWL组相比，MBL使麻醉-脑电图状态迅速过渡到清醒-脑电图状态。停止七氟烷吸入后100s的EEG能量分析结果显示,与PWL组相比，MBL组小鼠delta波相对能量下降(p<0.01)，spindle,beta,lowgamma和highgamma波相对能量增加(p<0.05)，而theta和alpha波相对能量保持不变。
第二部分单色蓝光对七氟烷麻醉所致脑电爆发抑制的影响
方法：采用雄性C57BL/6J(C57)小鼠(10-12周龄,体重22-26g)作为研究对象,所有实验都是在白天(8:00 am-5:00 pm)进行。将置了EEG-EMG电极的C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内并暴露在室内环境光下，2.5%七氟烷连续麻醉30min后，在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800lux的PWL或者MBL(460 nm)，继续2.5%七氟烷麻醉30min。从开始麻醉，全程记录小鼠的脑电和肌电，直至PWL或者MBL30min结束才停止记录。
结果：
1.在2.5%七氟烷连续麻醉时，与MBL暴露前10min相比，MBL暴露后第一个10min的BSR下降了31%(p<0.05)，MBL暴露后第二个10min的BSR下降了42%(p<0.01)，MBL暴露后第三个10min的BSR下降了55%(p<0.01)。然而，PWL暴露后第一个10min、第二个10min、第三个10min的BSR均与PWL暴露前10min的BSR无显著差异。
2.脑电分析结果显示，在2.5%七氟烷连续麻醉下，MBL改变了爆发抑制的脑电波模式，导致更多的爆发产生，并且同一小鼠的脑电能量频谱显示，MBL暴露后的EEG能量明显高于MBL暴露前。而PWL暴露前后的EEG振幅、频率和能量均没有变化。MBL暴露前后120s的绝对能量频谱密度比较结果显示，与MBL暴露前相比，除了spindle波，其他所有频段的能量均显著增加(p<0.05)。而PWL暴露前后120s的绝对能量频谱密度比较结果显示，PWL暴露后的EEG能量在所有频段与PWL暴露前无统计学差异。
第三部分单色蓝光通过激活SCN对七氟烷麻醉发挥促觉醒作用
方法：采用雄性C57BL/6J(C57)小鼠(10-12周龄,体重22-26g)作为研究对象，所有实验都是在白天(8:00 am-5:00 pm)进行。
1.观察七氟烷麻醉下单色蓝光对SCN神经元c-Fos表达的影响：将C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内并暴露在室内环境光下，2.5%七氟烷连续麻醉30min后，在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800lux的PWL或者MBL(460 nm)，继续2.5%七氟烷麻醉30min。七氟烷麻醉后，立即用1%戊巴比妥钠(100mg/kg, i.p)对小鼠进行深度麻醉，然后心脏多聚甲醛灌注取材，采用免疫荧光法检测SCN神经元活化情况。
2.观察七氟烷麻醉下单色蓝光对SCN局部场电位(LFP)的影响：将置了EEG-EMG和LFP电极的C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内并暴露在室内环境光下，2.5%七氟烷连续麻醉30min后，在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800lux的PWL或者MBL(460 nm)，继续2.5%七氟烷麻醉30min。从开始麻醉，全程记录小鼠的脑电、肌电和场电位，直至PWL或者MBL30min结束才停止记录。
3.SCN双侧电毁损：将40只雄性C57小鼠随机分成Sham组和SCN-lesioned(SCNx)组，每组20只。Sham组：将毁损电极置入小鼠双侧SCN，不通电流，停留20s后取出电极。SCNx组：将毁损电极置入小鼠双侧SCN，通入2.5mA的电流，持续20s后取出电极。
4.观察SCN毁损后单色蓝光对七氟烷麻醉诱导的影响：将14只Sham组小鼠随机分成PWL组和MBL组，每组7只。将14只SCNx组小鼠随机分成PWL组和MBL组，每组7只。检测每组小鼠LORR时间的方法同第一部分。
5.观察SCN毁损后单色蓝光对七氟烷麻醉苏醒的影响：将16只Sham组小鼠随机分成PWL组和MBL组，每组8只。将16只SCNx组小鼠随机分成PWL组和MBL组，每组8只。检测每组小鼠RORR时间的方法同第一部分。
6.观察SCN毁损后单色蓝光在七氟烷麻醉苏醒时对EEG的影响：将12只Sham组小鼠随机分成PWL组和MBL组，每组6只。将12只SCNx组小鼠随机分成PWL组和MBL组，每组6只。每组脑电监测的方法同第一部分。
7.观察SCN毁损后单色蓝光对七氟烷麻醉所致脑电爆发抑制的影响：将16只Sham组小鼠随机分成PWL组和MBL组，每组8只。将16只SCNx组小鼠随机分成PWL组和MBL组，每组8只。每组脑电监测的方法同第二部分。
结果：
1.免疫荧光结果显示，与PWL组相比，MBL组小鼠SCNc-Fos表达水平显著升高(p<0.0001)。
2.局部场电位结果显示，与MBL暴露前相比，MBL暴露后小鼠SCN局部场电位总能量显著增加(p＜0.05)。而PWL暴露前后小鼠SCN局部场电位差异无统计学意义。
3.采用尼氏染色观察所有SCN毁损组(SCNx)和假毁损组(Sham)小鼠的SCN连续切片。结果显示Sham组小鼠SCN完整，均匀对称分布在第三脑室两侧。而SCNx组小鼠SCN被直流电流毁损后，原SCN位置处呈空泡状，说明SCN毁损完全。
4.行为学结果显示，在七氟烷麻醉诱导过程中，Sham+MBL组(171.3s±11.72)与Sham+PWL组(186.1s±11.59)小鼠翻正反射消失的时间没有显著差异。SCNx+MBL组(154.6s±8.78)与SCNx+PWL组(158.4s±9.604)小鼠翻正反射消失的时间也没有显著差异。
5.行为学结果显示，在七氟烷麻醉苏醒过程中，MBL促进了Sham组小鼠七氟烷麻醉苏醒，Sham+MBL组(60.13s±13.38)与Sham+PWL组(147.9s±16.27)小鼠翻正反射恢复的时间有显著差异(p＜0.001)。而MBL对SCNx组小鼠七氟烷麻醉苏醒无影响，SCNx+MBL组(147.6s±12.71)与SCNx+PWL组(156.8s±12.32)小鼠翻正反射恢复的时间无显著差异。
6.脑电分析结果表明，在七氟烷麻醉苏醒期间，与Sham+PWL组相比，Sham+MBL组使麻醉-脑电图状态迅速过渡到清醒-脑电图状态。而在SCNx组小鼠，MBL未发生此种变化，并和PWL暴露后对皮层脑电的影响一致。停止七氟烷吸入后100s的EEG能量分析结果显示,与Sham+PWL组相比，Sham+MBL组小鼠delta波相对能量显著下降(p<0.0001)，theta、beta、lowgamma和highgamma波相对能量显著增加(p<0.05)，而alpha和spindle波相对能量保持不变。而在SCNx组小鼠，经MBL暴露的EEG能量与经PWL暴露的EEG能量在各频段均无明显差异。
7.爆发抑制的结果显示，在2.5%七氟烷连续麻醉时，与Sham+MBL暴露前10min相比，Sham+MBL暴露后第一个10min的BSR下降了21%(p<0.01)，Sham+MBL暴露后第二个10min的BSR下降了39%(p<0.01)，Sham+MBL暴露后第三个10min的BSR下降了56%(p<0.001)。然而，Sham+PWL暴露后第一个10min、第二个10min、第三个10min的BSR均与Sham+PWL暴露前10min的BSR无显著差异。而在SCNx组小鼠，MBL暴露后第一个10min、第二个10min、第三个10min的BSR均与MBL暴露前10min的BSR无显著差异。PWL暴露后第一个10min、第二个10min、第三个10min的BSR均与PWL暴露前10min的BSR无显著差异。
8.爆发抑制期间脑电分析结果显示，假毁损组(Sham)小鼠在2.5%七氟烷连续麻醉下，MBL改变了爆发抑制的脑电波模式，导致更多的爆发产生，并且同一小鼠的脑电能量频谱自身对照显示，MBL暴露后的EEG能量明显高于MBL暴露前。而PWL暴露前后的EEG振幅、频率和能量均没有变化。MBL暴露前后120s的绝对能量频谱密度比较结果显示，与MBL暴露前相比，MBL暴露后所有频段的能量均显著增加(p<0.05)。而PWL暴露前后120s的绝对能量频谱密度比较结果显示，PWL暴露后的EEG能量在所有频段与PWL暴露前无统计学差异。SCN毁损组(SCNx)小鼠在2.5%七氟烷连续麻醉下，MBL不改变爆发抑制的脑电波模式，并且同一小鼠的脑电能量频谱自身前后对照显示，MBL暴露后的EEG能量与MBL暴露前无明显变化。此外，PWL暴露前后的EEG振幅、频率和能量均没有变化。MBL暴露前后120s的绝对能量频谱密度比较结果显示，MBL暴露后的EEG能量在所有频段与MBL暴露前无统计学差异。而PWL暴露前后120s的绝对能量频谱密度比较结果显示，PWL暴露后的EEG能量在所有频段与PWL暴露前无统计学差异。
第四部分SCN下游促觉醒核团激活参与单色蓝光对七氟烷麻醉发挥促觉醒作用
方法：采用雄性C57BL/6J(C57)小鼠(10-12周龄,体重22-26g)作为研究对象，所有实验都是在白天(8:00 am-5:00 pm)进行。将C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内并暴露在室内环境光下，2.5%七氟烷连续麻醉30min后，在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800lux的PWL或者MBL(460 nm)，继续2.5%七氟烷麻醉30min。七氟烷麻醉后，立即用1%戊巴比妥钠(100mg/kg, i.p)对小鼠进行深度麻醉，然后心脏多聚甲醛灌注取材，采用免疫荧光法检测SCN下游相关脑区的神经元活化情况。
结果：免疫荧光结果显示，与PWL组相比，MBL组小鼠VLPOc-Fos表达水平无明显差异，LCTH和c-Fos均阳性的表达水平无明显差异，但LHc-Fos的表达水平显著增加(p<0.0001)，PFCc-Fos的表达水平显著增加(p<0.0001)。
统计学分析
所有数据采用均数±标准误表示，并用GraphPadPrism6进行统计学分析。SCN毁损前的行为学结果(Timetoinduction和Timetoemergence)和EEG各频段相对能量频谱密度以及免疫荧光结果采用独立样本非配对t检验以及韦尔奇校正(Welch’s correction)。重复测量设计(BSR)中的组间比较采用重复测量单因素方差分析(repeated measures (RM)one-way ANOVA)进行检验，多假设检验采用Tukey’s多重比较检验。SCN毁损后的行为学结果和EEG各频段相对能量频谱密度采用普通的单因素方差分析(ordinary one-way ANOVA)进行检验，多假设检验采用Tukey’s多重比较检验。采用配对t检验分析光源处理前后的EEG各频段绝对能量频谱密度和LFP整个频段的绝对能量频谱密度。p＜0.05认为差异具有统计学意义。
研究总结
1.主要研究结果
1.1在1MAC七氟烷麻醉诱导过程中，单色蓝光不改变小鼠翻正反射消失的时间。而在1MAC七氟烷麻醉苏醒过程中，单色蓝光缩短了小鼠翻正反射恢复的时间，并且单色蓝光显著降低了皮层脑电的delta波相对能量，增加spindle、beta、lowgamma和highgamma波相对能量。
1.2在2.5%七氟烷麻醉维持过程中，单色蓝光可以显著降低2.5%七氟烷连续麻醉时的爆发抑制率(BSR)，且随暴露时间的延长，对BSR的影响越明显。此外，脑电频谱分析结果表明，2.5%七氟烷持续麻醉时，单色蓝光可以显著增加除spindle波外EEG各频段的绝对能量。
1.3单色蓝光可以显著上调七氟烷麻醉下SCN神经元c-Fos的表达水平，并可显著增强七氟烷麻醉下SCNLFP活动。SCN电毁损后，单色蓝光对七氟烷麻醉的诱导时间和觉醒时间均不产生影响，并且也不影响2.5%七氟烷连续麻醉时的BSR。此外，脑电分析结果表明，SCN电毁损后，单色蓝光对七氟烷麻醉苏醒时各频段的EEG能量均无影响，也不影响2.5%七氟烷连续麻醉时各频段的EEG能量。
1.4单色蓝光可以显著上调七氟烷麻醉下LH和PFC的c-Fos表达水平，而对促觉醒核团LC和促睡眠核团VLPOc-Fos表达水平无影响。
2.研究结论
2.1单色蓝光可以显著加快七氟烷麻醉苏醒而不影响麻醉诱导。
2.2单色蓝光可以减少2.5%七氟烷连续麻醉时爆发抑制的产生。
2.3单色蓝光通过激活SCN在七氟烷麻醉中发挥减浅麻醉和促觉醒作用。
2.4SCN下游促觉醒核团激活与单色蓝光在七氟烷麻醉中的促觉醒作用有关。
3.创新之处
3.1发现单色蓝光可以促进七氟烷麻醉苏醒。
3.2发现单色蓝光可以减少七氟烷麻醉爆发抑制的产生。
3.3揭示了SCN激活参与单色蓝光减浅七氟烷麻醉深度和促进觉醒的机制。
3.4本研究为利用自然的环境因素促进全身麻醉苏醒和处理全身麻醉苏醒延迟提供了新的思路。
4.展望
4.1目前还没有临床批准上市的药物，能安全有效地常规用于临床促进全麻苏醒。在本研究中，作为一种简单易行的非药物干预手段，利用自然的单色蓝光环境可以在停止七氟烷吸入后促进大脑皮层觉醒，缩短苏醒时间。此外，在连续七氟烷深麻醉下，单色蓝光增加了大脑皮层兴奋性并降低了爆发抑制率，有减浅麻醉的效果。苏醒期给与单色蓝光可能作为一种简单有效的非药物自然促觉醒方法应用于临床，特别是全麻后苏醒延迟者。
4.2蓝光已被证实可以影响免疫，提高细菌清除率，减轻炎症反应，降低氧化应激。Zhou等人发现药物遗传学激活小鼠LH促食欲素能神经元促进异氟烷麻醉苏醒。在本研究中，我们发现七氟烷麻醉下单色蓝光可激活LH神经元，而LH中主要是促食欲素能神经元，可能是蓝光促进觉醒的机制。文献报道激活促食欲素能神经元能发挥镇痛作用。Ibrahim等人的一项研究也报道了蓝光可以提高正常大鼠的热痛阈。因此临床上在苏醒期给予蓝光环境可能不仅有助于加快麻醉苏醒，而且还可能发挥减轻疼痛和炎症的作用，这一假设仍需进一步的临床研究来证实。
单色蓝光(monochromatic blue light, MBL)的波长在400nm~490nm之间，对生物机体既有利也有害。其中415~455nm之间的蓝光波长短、能量高，可直接穿透晶状体到达眼底的视网膜，从而导致视网膜细胞发生衰亡，此波段的蓝光是有害蓝光；波段在455nm~490nm的蓝光，有调整生物节律的作用，睡眠-觉醒、认知、情绪、记忆力等都与其密切相关，此波段的蓝光是有益蓝光。固有的自主感光性视网膜神经节细胞(intrinsically photosensitive retinal ganglion cells, ipRGCs)对波长在460~480nm之间的蓝光特别敏感，在蓝光参与调节睡眠-觉醒中发挥了重要作用。动物研究表明，470nm的蓝光通过ipRGCs表达的M1型黑视蛋白增加觉醒时间。临床研究表明，晚上暴露于460nm的单色蓝光2小时，在第一个睡眠周期可有效降低慢波活动(slow wave activity，SWA:0.75–4.5 Hz)，而在第三个睡眠周期时可以增加前额的SWA，并在第一个和第三个睡眠周期均可缩短快速眼动睡眠(rapid eye movement sleep，REMS)时间。越来越多的研究表明全身麻醉与睡眠-觉醒有部分共同的神经环路机制，调控调节睡眠-觉醒的某些特定核团或者神经递质，可影响全麻的全身作用。麻醉药物也可以作用于睡眠中枢，如丙泊酚麻醉接近自然睡眠的状态，可产生类似于非快速眼动睡眠(non-rapid eye movement sleep，NREMS)的脑电图(electroencephalogram, EEG)，但单色蓝光是否影响全身麻醉尚不清楚。
哺乳动物下丘脑视交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)是机体主要的中枢神经系统昼夜节律起搏点，调控着包括睡眠-觉醒在内的24小时生物节律。光作为最有效的环境刺激之一，在哺乳动物中具有视觉图像形成和非视觉图像形成(non-image-forming, NIF)功能。光通过表达在ipRGCs上的黑视蛋白直接或者间接影响NIF功能。其中ipRGCs投射到SCN发挥包括同步昼夜节律生物钟，抑制松果体褪黑素分泌，调节瞳孔对光反射，改变睡眠和觉醒，影响情绪和认知等不同作用。最新的研究表明，蓝光使得小鼠SCN的FosmRNA的表达增加，导致肾上腺自主神经支配的皮质酮升高，从而增加小鼠的觉醒行为。此外，SCN作为光调节睡眠-觉醒的信息整合中枢，将单突触和多突触连接投射到与睡眠-觉醒相关的下丘脑内，从而影响睡眠和觉醒。研究表明SCN向下丘脑背内侧核(dorsomedial hypothalamus，DMH)有密集的投射，DMH将抑制性的γ-氨基丁酸能神经纤维投射至腹外侧视前核(ventrolateral preoptic nucleus， VLPO)，将兴奋性的谷氨酸能神经纤维投射至外侧下丘(lateral hypothalamus，LH)。此外，SCN也可通过DMH投射到蓝斑(locus coeruleus，LC)，从而兴奋睡眠-觉醒网络中的促觉醒神经元以及大脑皮层发挥促觉醒作用。Pilorz等人的研究表明环境蓝光通过激活SCN对C57BL/6小鼠发挥促觉醒作用，而环境绿光通过兴奋VLPO则表现出相反的效应，即促睡眠作用。因此单色蓝光是否通过SCN以及SCN下游核团影响七氟烷麻醉诱导、维持和苏醒目前尚不明确。
为探讨单色环境蓝光对七氟烷麻醉的影响及其机制，我们测量了翻正反射消失(loss of righting reflex, LORR)时间与翻正反射恢复(recovery of righting reflex, RORR)时间，以观察单色蓝光对七氟烷麻醉诱导和苏醒的影响。然后，通过记录皮层脑电图(electroencephalogram, EEG)和肌电图(electromyogram, EMG)监测七氟烷麻醉下的爆发抑制，计算EEG爆发抑制率(burst-suppression ratio，BSR)和EEG频谱能量，以评估七氟烷麻醉下单色蓝光对爆发抑制的影响。采用免疫荧光染色和局部场电位(local field potential，LFP)记录来观察七氟烷麻醉下单色蓝光对SCN神经元活性的影响。通过对小鼠双侧SCN核团的局部电毁损建立SCN毁损模型，采用行为学、EEG–EMG监测进一步证实SCN参与了单色蓝光对七氟烷麻醉的促觉醒作用。最后，我们采用免疫荧光染色观察在七氟烷麻醉下SCN典型投射区c-Fos的表达，探讨其下游的可能机制。
研究方法与结果
第一部分单色蓝光对七氟烷麻醉诱导和苏醒的影响
方法：采用雄性C57BL/6J(C57)小鼠(10-12周龄,体重22-26g)作为研究对象，所有实验都是在白天(8:00 am-5:00 pm)进行。
1.观察单色蓝光对七氟烷麻醉诱导的影响：在七氟烷麻醉开始前，将C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内适应30min并暴露在室内环境光下，当开始1MAC七氟烷麻醉的同时，在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800lux的多色白光(polychromatic white light, PWL)或者单色蓝光(monochromatic blue light, MBL)(460 nm),待小鼠翻正反射消失时，观察记录PWL或者MBL对小鼠LORR时间的影响。
2.观察单色蓝光对七氟烷麻醉苏醒的影响：将C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内维持1MAC七氟烷麻醉30min并暴露在室内环境光下，当停止七氟烷麻醉的同时，在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800lux的PWL或者MBL(460 nm)，待小鼠翻正反射恢复时，观察记录PWL或者MBL对小鼠RORR时间的影响。
3.观察单色蓝光在七氟烷麻醉苏醒时对EEG的影响：将置了EEG-EMG电极的C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内维持1MAC七氟烷麻醉30min并暴露在室内环境光下，当停止七氟烷麻醉的同时，在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800lux的PWL或者MBL(460 nm)。从开始麻醉，全程记录小鼠的脑电和肌电，直至小鼠意识完全恢复，出现体动后停止记录。
结果：
1.在七氟烷麻醉诱导过程中，与PWL组(181.1s±10.60)相比，MBL组(176.0s±7.976)小鼠七氟烷麻醉诱导翻正反射消失的时间没有显著差异。
2.在七氟烷麻醉苏醒过程中，与PWL组(133.1s±13.53)相比，MBL组(38.75s±5.291)小鼠七氟烷麻醉苏醒翻正反射恢复的时间显著缩短(p＜0.001)。
3.脑电分析结果表明，在七氟烷麻醉苏醒期间，与PWL组相比，MBL使麻醉-脑电图状态迅速过渡到清醒-脑电图状态。停止七氟烷吸入后100s的EEG能量分析结果显示,与PWL组相比，MBL组小鼠delta波相对能量下降(p<0.01)，spindle,beta,lowgamma和highgamma波相对能量增加(p<0.05)，而theta和alpha波相对能量保持不变。
第二部分单色蓝光对七氟烷麻醉所致脑电爆发抑制的影响
方法：采用雄性C57BL/6J(C57)小鼠(10-12周龄,体重22-26g)作为研究对象,所有实验都是在白天(8:00 am-5:00 pm)进行。将置了EEG-EMG电极的C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内并暴露在室内环境光下，2.5%七氟烷连续麻醉30min后，在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800lux的PWL或者MBL(460 nm)，继续2.5%七氟烷麻醉30min。从开始麻醉，全程记录小鼠的脑电和肌电，直至PWL或者MBL30min结束才停止记录。
结果：
1.在2.5%七氟烷连续麻醉时，与MBL暴露前10min相比，MBL暴露后第一个10min的BSR下降了31%(p<0.05)，MBL暴露后第二个10min的BSR下降了42%(p<0.01)，MBL暴露后第三个10min的BSR下降了55%(p<0.01)。然而，PWL暴露后第一个10min、第二个10min、第三个10min的BSR均与PWL暴露前10min的BSR无显著差异。
2.脑电分析结果显示，在2.5%七氟烷连续麻醉下，MBL改变了爆发抑制的脑电波模式，导致更多的爆发产生，并且同一小鼠的脑电能量频谱显示，MBL暴露后的EEG能量明显高于MBL暴露前。而PWL暴露前后的EEG振幅、频率和能量均没有变化。MBL暴露前后120s的绝对能量频谱密度比较结果显示，与MBL暴露前相比，除了spindle波，其他所有频段的能量均显著增加(p<0.05)。而PWL暴露前后120s的绝对能量频谱密度比较结果显示，PWL暴露后的EEG能量在所有频段与PWL暴露前无统计学差异。
第三部分单色蓝光通过激活SCN对七氟烷麻醉发挥促觉醒作用
方法：采用雄性C57BL/6J(C57)小鼠(10-12周龄,体重22-26g)作为研究对象，所有实验都是在白天(8:00 am-5:00 pm)进行。
1.观察七氟烷麻醉下单色蓝光对SCN神经元c-Fos表达的影响：将C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内并暴露在室内环境光下，2.5%七氟烷连续麻醉30min后，在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800lux的PWL或者MBL(460 nm)，继续2.5%七氟烷麻醉30min。七氟烷麻醉后，立即用1%戊巴比妥钠(100mg/kg, i.p)对小鼠进行深度麻醉，然后心脏多聚甲醛灌注取材，采用免疫荧光法检测SCN神经元活化情况。
2.观察七氟烷麻醉下单色蓝光对SCN局部场电位(LFP)的影响：将置了EEG-EMG和LFP电极的C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内并暴露在室内环境光下，2.5%七氟烷连续麻醉30min后，在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800lux的PWL或者MBL(460 nm)，继续2.5%七氟烷麻醉30min。从开始麻醉，全程记录小鼠的脑电、肌电和场电位，直至PWL或者MBL30min结束才停止记录。
3.SCN双侧电毁损：将40只雄性C57小鼠随机分成Sham组和SCN-lesioned(SCNx)组，每组20只。Sham组：将毁损电极置入小鼠双侧SCN，不通电流，停留20s后取出电极。SCNx组：将毁损电极置入小鼠双侧SCN，通入2.5mA的电流，持续20s后取出电极。
4.观察SCN毁损后单色蓝光对七氟烷麻醉诱导的影响：将14只Sham组小鼠随机分成PWL组和MBL组，每组7只。将14只SCNx组小鼠随机分成PWL组和MBL组，每组7只。检测每组小鼠LORR时间的方法同第一部分。
5.观察SCN毁损后单色蓝光对七氟烷麻醉苏醒的影响：将16只Sham组小鼠随机分成PWL组和MBL组，每组8只。将16只SCNx组小鼠随机分成PWL组和MBL组，每组8只。检测每组小鼠RORR时间的方法同第一部分。
6.观察SCN毁损后单色蓝光在七氟烷麻醉苏醒时对EEG的影响：将12只Sham组小鼠随机分成PWL组和MBL组，每组6只。将12只SCNx组小鼠随机分成PWL组和MBL组，每组6只。每组脑电监测的方法同第一部分。
7.观察SCN毁损后单色蓝光对七氟烷麻醉所致脑电爆发抑制的影响：将16只Sham组小鼠随机分成PWL组和MBL组，每组8只。将16只SCNx组小鼠随机分成PWL组和MBL组，每组8只。每组脑电监测的方法同第二部分。
结果：
1.免疫荧光结果显示，与PWL组相比，MBL组小鼠SCNc-Fos表达水平显著升高(p<0.0001)。
2.局部场电位结果显示，与MBL暴露前相比，MBL暴露后小鼠SCN局部场电位总能量显著增加(p＜0.05)。而PWL暴露前后小鼠SCN局部场电位差异无统计学意义。
3.采用尼氏染色观察所有SCN毁损组(SCNx)和假毁损组(Sham)小鼠的SCN连续切片。结果显示Sham组小鼠SCN完整，均匀对称分布在第三脑室两侧。而SCNx组小鼠SCN被直流电流毁损后，原SCN位置处呈空泡状，说明SCN毁损完全。
4.行为学结果显示，在七氟烷麻醉诱导过程中，Sham+MBL组(171.3s±11.72)与Sham+PWL组(186.1s±11.59)小鼠翻正反射消失的时间没有显著差异。SCNx+MBL组(154.6s±8.78)与SCNx+PWL组(158.4s±9.604)小鼠翻正反射消失的时间也没有显著差异。
5.行为学结果显示，在七氟烷麻醉苏醒过程中，MBL促进了Sham组小鼠七氟烷麻醉苏醒，Sham+MBL组(60.13s±13.38)与Sham+PWL组(147.9s±16.27)小鼠翻正反射恢复的时间有显著差异(p＜0.001)。而MBL对SCNx组小鼠七氟烷麻醉苏醒无影响，SCNx+MBL组(147.6s±12.71)与SCNx+PWL组(156.8s±12.32)小鼠翻正反射恢复的时间无显著差异。
6.脑电分析结果表明，在七氟烷麻醉苏醒期间，与Sham+PWL组相比，Sham+MBL组使麻醉-脑电图状态迅速过渡到清醒-脑电图状态。而在SCNx组小鼠，MBL未发生此种变化，并和PWL暴露后对皮层脑电的影响一致。停止七氟烷吸入后100s的EEG能量分析结果显示,与Sham+PWL组相比，Sham+MBL组小鼠delta波相对能量显著下降(p<0.0001)，theta、beta、lowgamma和highgamma波相对能量显著增加(p<0.05)，而alpha和spindle波相对能量保持不变。而在SCNx组小鼠，经MBL暴露的EEG能量与经PWL暴露的EEG能量在各频段均无明显差异。
7.爆发抑制的结果显示，在2.5%七氟烷连续麻醉时，与Sham+MBL暴露前10min相比，Sham+MBL暴露后第一个10min的BSR下降了21%(p<0.01)，Sham+MBL暴露后第二个10min的BSR下降了39%(p<0.01)，Sham+MBL暴露后第三个10min的BSR下降了56%(p<0.001)。然而，Sham+PWL暴露后第一个10min、第二个10min、第三个10min的BSR均与Sham+PWL暴露前10min的BSR无显著差异。而在SCNx组小鼠，MBL暴露后第一个10min、第二个10min、第三个10min的BSR均与MBL暴露前10min的BSR无显著差异。PWL暴露后第一个10min、第二个10min、第三个10min的BSR均与PWL暴露前10min的BSR无显著差异。
8.爆发抑制期间脑电分析结果显示，假毁损组(Sham)小鼠在2.5%七氟烷连续麻醉下，MBL改变了爆发抑制的脑电波模式，导致更多的爆发产生，并且同一小鼠的脑电能量频谱自身对照显示，MBL暴露后的EEG能量明显高于MBL暴露前。而PWL暴露前后的EEG振幅、频率和能量均没有变化。MBL暴露前后120s的绝对能量频谱密度比较结果显示，与MBL暴露前相比，MBL暴露后所有频段的能量均显著增加(p<0.05)。而PWL暴露前后120s的绝对能量频谱密度比较结果显示，PWL暴露后的EEG能量在所有频段与PWL暴露前无统计学差异。SCN毁损组(SCNx)小鼠在2.5%七氟烷连续麻醉下，MBL不改变爆发抑制的脑电波模式，并且同一小鼠的脑电能量频谱自身前后对照显示，MBL暴露后的EEG能量与MBL暴露前无明显变化。此外，PWL暴露前后的EEG振幅、频率和能量均没有变化。MBL暴露前后120s的绝对能量频谱密度比较结果显示，MBL暴露后的EEG能量在所有频段与MBL暴露前无统计学差异。而PWL暴露前后120s的绝对能量频谱密度比较结果显示，PWL暴露后的EEG能量在所有频段与PWL暴露前无统计学差异。
第四部分SCN下游促觉醒核团激活参与单色蓝光对七氟烷麻醉发挥促觉醒作用
方法：采用雄性C57BL/6J(C57)小鼠(10-12周龄,体重22-26g)作为研究对象，所有实验都是在白天(8:00 am-5:00 pm)进行。将C57小鼠置于圆柱形玻璃麻醉室内并暴露在室内环境光下，2.5%七氟烷连续麻醉30min后，在无其他光源的圆柱形玻璃麻醉室内施加800lux的PWL或者MBL(460 nm)，继续2.5%七氟烷麻醉30min。七氟烷麻醉后，立即用1%戊巴比妥钠(100mg/kg, i.p)对小鼠进行深度麻醉，然后心脏多聚甲醛灌注取材，采用免疫荧光法检测SCN下游相关脑区的神经元活化情况。
结果：免疫荧光结果显示，与PWL组相比，MBL组小鼠VLPOc-Fos表达水平无明显差异，LCTH和c-Fos均阳性的表达水平无明显差异，但LHc-Fos的表达水平显著增加(p<0.0001)，PFCc-Fos的表达水平显著增加(p<0.0001)。
统计学分析
所有数据采用均数±标准误表示，并用GraphPadPrism6进行统计学分析。SCN毁损前的行为学结果(Timetoinduction和Timetoemergence)和EEG各频段相对能量频谱密度以及免疫荧光结果采用独立样本非配对t检验以及韦尔奇校正(Welch’s correction)。重复测量设计(BSR)中的组间比较采用重复测量单因素方差分析(repeated measures (RM)one-way ANOVA)进行检验，多假设检验采用Tukey’s多重比较检验。SCN毁损后的行为学结果和EEG各频段相对能量频谱密度采用普通的单因素方差分析(ordinary one-way ANOVA)进行检验，多假设检验采用Tukey’s多重比较检验。采用配对t检验分析光源处理前后的EEG各频段绝对能量频谱密度和LFP整个频段的绝对能量频谱密度。p＜0.05认为差异具有统计学意义。
研究总结
1.主要研究结果
1.1在1MAC七氟烷麻醉诱导过程中，单色蓝光不改变小鼠翻正反射消失的时间。而在1MAC七氟烷麻醉苏醒过程中，单色蓝光缩短了小鼠翻正反射恢复的时间，并且单色蓝光显著降低了皮层脑电的delta波相对能量，增加spindle、beta、lowgamma和highgamma波相对能量。
1.2在2.5%七氟烷麻醉维持过程中，单色蓝光可以显著降低2.5%七氟烷连续麻醉时的爆发抑制率(BSR)，且随暴露时间的延长，对BSR的影响越明显。此外，脑电频谱分析结果表明，2.5%七氟烷持续麻醉时，单色蓝光可以显著增加除spindle波外EEG各频段的绝对能量。
1.3单色蓝光可以显著上调七氟烷麻醉下SCN神经元c-Fos的表达水平，并可显著增强七氟烷麻醉下SCNLFP活动。SCN电毁损后，单色蓝光对七氟烷麻醉的诱导时间和觉醒时间均不产生影响，并且也不影响2.5%七氟烷连续麻醉时的BSR。此外，脑电分析结果表明，SCN电毁损后，单色蓝光对七氟烷麻醉苏醒时各频段的EEG能量均无影响，也不影响2.5%七氟烷连续麻醉时各频段的EEG能量。
1.4单色蓝光可以显著上调七氟烷麻醉下LH和PFC的c-Fos表达水平，而对促觉醒核团LC和促睡眠核团VLPOc-Fos表达水平无影响。
2.研究结论
2.1单色蓝光可以显著加快七氟烷麻醉苏醒而不影响麻醉诱导。
2.2单色蓝光可以减少2.5%七氟烷连续麻醉时爆发抑制的产生。
2.3单色蓝光通过激活SCN在七氟烷麻醉中发挥减浅麻醉和促觉醒作用。
2.4SCN下游促觉醒核团激活与单色蓝光在七氟烷麻醉中的促觉醒作用有关。
3.创新之处
3.1发现单色蓝光可以促进七氟烷麻醉苏醒。
3.2发现单色蓝光可以减少七氟烷麻醉爆发抑制的产生。
3.3揭示了SCN激活参与单色蓝光减浅七氟烷麻醉深度和促进觉醒的机制。
3.4本研究为利用自然的环境因素促进全身麻醉苏醒和处理全身麻醉苏醒延迟提供了新的思路。
4.展望
4.1目前还没有临床批准上市的药物，能安全有效地常规用于临床促进全麻苏醒。在本研究中，作为一种简单易行的非药物干预手段，利用自然的单色蓝光环境可以在停止七氟烷吸入后促进大脑皮层觉醒，缩短苏醒时间。此外，在连续七氟烷深麻醉下，单色蓝光增加了大脑皮层兴奋性并降低了爆发抑制率，有减浅麻醉的效果。苏醒期给与单色蓝光可能作为一种简单有效的非药物自然促觉醒方法应用于临床，特别是全麻后苏醒延迟者。
4.2蓝光已被证实可以影响免疫，提高细菌清除率，减轻炎症反应，降低氧化应激。Zhou等人发现药物遗传学激活小鼠LH促食欲素能神经元促进异氟烷麻醉苏醒。在本研究中，我们发现七氟烷麻醉下单色蓝光可激活LH神经元，而LH中主要是促食欲素能神经元，可能是蓝光促进觉醒的机制。文献报道激活促食欲素能神经元能发挥镇痛作用。Ibrahim等人的一项研究也报道了蓝光可以提高正常大鼠的热痛阈。因此临床上在苏醒期给予蓝光环境可能不仅有助于加快麻醉苏醒，而且还可能发挥减轻疼痛和炎症的作用，这一假设仍需进一步的临床研究来证实。