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背景:研究表明靶向药物可以杀死携带特定基因突变的肿瘤细胞,而个体遗传差异影响肿瘤细胞对靶向药物的敏感性。因此靶向用药前的伴随诊断可以促进肿瘤个体化诊疗。高通量测序(next-generation sequence,NGS)技术可以实现肿瘤个体化诊疗相关基因突变的并行检测,给临床治疗辅助诊断带来极大帮助。但NGS存在的检测误差会直接导致靶向治疗目标人群的选择失误。因此,NGS检测实验室须设置验证试验,采用参考品进行检测流程质控和性能评估。目前中国正在加紧开发研制乳腺癌和肺癌靶向用药相关基因的NGS试剂盒。因此针对相应试剂盒参考品的研制需求迫切。然而目前用于NGS实验室质控管理的参考品十分有限,而且价格昂贵。因此,本研究通过对乳腺癌和肺癌靶向用药伴随诊断参考品的研制以及参考品相关原材料和工艺的探索,旨在建立一套稳定、可重复获取肿瘤参考品的制备方案。方法:(1)依据ACMG指南和中国人群乳腺癌BRCA基因特点,制定了适合中国人群的BRCA变异解读规则;根据中国人群特点筛选了BRCA1/2突变临床乳腺癌和细胞系样本基因位点,制备了基于NGS检测的实物参考品;并根据NGS测序数据建立针对BRCA突变解读的数字参考品,进一步提高检测实验室的水平与判读能力;通过企业协作标定证实了参考品的可靠性、准确性、稳定性和均匀性。(2)通过NGS和数字PCR对组织样本进行突变检测和频率定值,制备了肺癌靶向治疗基因检测参考品。(3)从突变频率入手,对35株细胞进行突变定频,并对比临床组织、细胞株以及质粒样本制备不同突变频率混合样本的实际频率,探索三种样本制备肿瘤参考品的可靠性和合理性。同时探索了模拟循环肿瘤 DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)制备 ctDNA 参考品。结果:(1)建立了符合中国人群BRCA突变特点的变异解读规则。研制了包括31个BRCA1/2突变位点的实物参考品,以及包括750个非重复BRCA突变的数字参考品。基于BRCA变异数据集建立了适用于NGS检测BRCA变异解读性能评估的在线系统。(2)研制了包含肺癌靶向治疗相关基因EGFR、KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、ALK和MET共30个突变位点检测的参考品。参考品包括阳性参考品、阴性参考品以及检测限参考品;(3)筛选到24株可用于肿瘤参考品制备的细胞株并确定相应突变类型和频率。初步建立ctDNA参考品制备流程,并制备EGFR、KRAS和BRAF突变ctDNA参考品。结论:本研究建立了BRCA基因突变NGS检测质控体系和肺癌靶向用药伴随诊断参考品,可以用于相应基因突变检测和解读流程的性能评价;以细胞株为材料初步建立了 ctDNA制备方案,可以为后续肿瘤参考品制备提供参考,为乳腺癌和肺癌靶向治疗伴随诊断的发展提供基础。总之,本课题研究为肿瘤靶向用药伴随诊断的发展提供借鉴,有利于促进NGS技术在临床分子诊断领域的发展。