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目的:研究Nrf2基因抑制及无机砷染毒对Nrf2通路相关基因及蛋白表达的影响,探讨其在砷致皮肤细胞氧化应激中的作用,为砷致皮肤损伤提供理论依据。方法:1.慢病毒载体的构建:依据Nrf2基因序列构建Nrf2 sh RNA,重组慢病毒表达载体,并进行测序鉴定。2.慢病毒包装:Keap1抑制质粒大量抽提扩增,共转293T细胞,收集病毒上清,测定病毒滴度。3.用不同的慢病毒载体(Nrf2 shRNA1/2/3和空载体)分别感染HaCaT细胞构建Nrf2基因抑制HaCaT细胞系,感染复数为5,48小时后,用1μg/ml嘌呤霉素筛选稳转株。4.稳转株的鉴定:培养经筛选获得的稳转株,通过实时荧光定量法检测细胞中Nrf2 mRNA表达水平。5.采用MTT还原法检测细胞生长状况,确定LC50及染毒浓度,染毒浓度分别为LC50的1/100、1/50、1/10。6.流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。7.RT-PCR检测细胞中Nrf2、Keap1、NF-κB、CBP、As3MT、K-1、K-10、INV、LOR mRNA表达水平。8.ELISA试剂盒检测细胞中HO-1、SAM、HCY、As3MT蛋白表达水平。结果:1.慢病毒干扰载体构建,经基因测序,与目的基因序列完全匹配,慢病毒滴度为2×108TU/ml。2.建立的Nrf2基因抑制稳转细胞株中sh3最好,其基因的沉默效率为87%,作为后续实验细胞。3.混合砷染毒模型细胞48h的LC50为210.00μmol/L,染毒浓度分别为LC50的1/100(2.10μmol/)L,LC50的1/50(4.20μmol/L),LC50的1/10(21.00μmol/L)。4.Keap1基因抑制、2.10μmol/L混合砷染毒促进细胞增殖,细胞生长速度加快;随染毒浓度增加(4.20μmol/L-21.00μmol/L)染毒时间延长(48h、72h)细胞多核细胞出现,脱壁明显。5.与Nrf2抑制对照组相比,8h和24h时2.1μmol/L、4.20μmol/L、21μmol/L浓度组早期凋亡率均升高,且随染毒浓度的增加,凋亡率增加;48h后其早凋亡率均降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。72h各浓度组早期凋亡率均低于空白对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。6.与Nrf2抑制对照组及8h相比,Keap1抑制对照组24h、48h、72hKeap1 mRNA表达均下调(P<0.01),且随时间延长呈下降趋势;2.1μmol/L、4.2μmol/L、21μmol/L浓度组Keap1 mRNA表达24h、48h均下调(P<0.01),表达随浓度增大呈上升趋势。与Nrf2抑制对照组相比,空白对照组和Keap1抑制对照组72hNrf2 mRNA表达均上调(P<0.01);2.1μmol/L浓度组24h、48h和72hNrf2 mRNA表达均上调(P<0.01);而4.2μmol/L和21μmol/L 24h、72hNrf2 m RNA表达均下调(P<0.01)。与空白对照组和Nrf2抑制对照组相比,较低浓度组(2.1、4.20μmol/L)细胞中NF-κB、CBP mRNA的表达上调;高浓度组(21.00μmol/L)长时间(48h、72h)NF-κB、CBP mRNA的表达下调,差异均有统计学意义(P<0.01)。各浓度组K-l mRNA在24h、48h时表达较空白对照组和Nrf2抑制对照组下调,72h明显上调,差异有统计学意义(P<0.01);与空白对照组和Nrf2抑制对照组相比,较低浓度组(2.10、4.20μmol/L)长时间(48h、72h)K-l0 m RNA的表达上调,高浓度组K-l0 mRNA总体呈下调状态,差异均有统计学意义(P<0.01)。与空白对照组和Nrf2抑制对照组相比,较低浓度组(2.10、4.20μmol/L)INV、LOR mRNA 24h和72h表达明显升高,48h表达下调,21μmol/L浓度组INV、LOR m RNA24h后均呈下调状态,差异均有统计学意义(P<0.01)。7.与空白对照组和Nrf2抑制对照组相比,4.2μmol/L和21μmol/L混合砷染毒促进As3MT mRNA表达,2.10、4.20μmol/L浓度组8h、24h、48hAs3MT蛋白含量下调,72h表达上调,21μmol/L浓度组长时间48h、72h As3MT蛋白含量上调,差异均有统计学意义(P<0.01)。8.与空白对照组相比,Keap1抑制对照组8h、48h和72hSAM蛋白含量均下调(P<0.01);Nrf2抑制对照组24h、48h和72hSAM蛋白含量均上调(P<0.01);与Nrf2抑制对照组相比,2.1μmol/L、4.2μmol/L、21μmol/L浓度组随时间延长(24h、48h、72h)SAM蛋白含量均下调(P<0.01),同时间不同浓度组随浓度升高,呈下降趋势,差异均有统计学意义(P<0.01)。与空白对照组和Nrf2抑制对照组相比,8h、24h、48h和72hHCY蛋白含量均上调,差异均有统计学意义(P<0.01);空白对照组和Keap1抑制对照组24h后HCY蛋白含量均低于Nrf2抑制对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。与空白对照组和Nrf2抑制对照组相比,2.10、4.20μmol/L浓度组HO-1蛋白含量由8h、24h的表达上调转至48h、72h表达逐渐下调,21μmol/L浓度组HO-1蛋白含量基本维持下调水平;且均随浓度增加表达逐渐降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:1.混合砷染毒能引起细胞形态改变,低浓度促进细胞增殖,高浓度促进细胞凋亡。2.Nrf2基因抑制联合混合砷染毒细胞,Nrf2通路相关基因(Nrf2、Keap1、NF-κB、CBP、As3MT、)及蛋白(HO-1、SAM、HCY、As3MT)表达发生改变;角化蛋白基因(K-1、K-10、INV、LOR)表达紊乱,能加速砷诱导的氧化应激反应。3.Nrf2基因抑制下,时间和浓度的交互影响着混合砷对模型细胞的毒性作用,因此,随着染毒时间的延长、染毒浓度的增大,砷暴露对皮肤细胞的氧化损害作用逐渐增大。