甘蓝型油菜是农业上重要的油料作物之一,它对全球油料种子的生产贡献巨大。在油菜种植过程中,油菜不断受到菌核病和倒伏的影响,导致大量降低油菜种子产量,并使种子的含油量降低,营养成分改变。木质素是存在于植物次生细胞壁中的复杂聚合物。对植物生长发育过程中的机械支撑,病虫害防御和水分运输起着十分重要的作用。木质素通过改变细胞壁的机械性能从而限制病原菌向宿主细胞的扩散以及获取宿主的营养物质。木质素的复杂性和特异性一般是由木质素单体间的比例及不同类型的化学键决定的,从而决定着植物内部结构的复杂性。陆生植物中G和S型木质素单体的生物合成受到发育调控,并且它们的比例对环境刺激（例如生物和非生物胁迫）有特殊反应。大量研究认为木质素单体间的比例与植株抗病能力有关,阿魏酸5-羟化酶（F5H,CYP84A1）参与木质素单体的生物合成,并最终改变维管植物中S型木质素单体的含量,F5H仅受NAC转录因子NST3的调控。本研究论文主要包括:首先构建甘蓝型油菜BnF5H-1基因的亚细胞定位载体,然后转化本氏烟草和洋葱下表皮细胞进行亚细胞水平的定位。构建BnF5H-1基因的超表达载体,成功构建载体后,将其遗传转化甘蓝型油菜中双11,并鉴定得到阳性的T2代转基因苗。对课题组之前已经获得的T1代BnF5H敲除转基因植株提取油菜转基因苗DNA,并扩增靶位点前后序列测序统计编辑结果。将具有编辑结果的转基因株系繁殖至T2代,提取油菜转基因苗DNA,并扩增靶位点前后序列测序统计编辑结果,鉴定得到具有编辑结果的T2代阳性转基因苗。构建BnF5H的转录调控因子BnNST3-2的酵母表达载体和亚细胞定位载体,并分别转化酵母细胞和本氏烟草。并对课题组之前已经构建好的BnNST3-2超表达载体将其转化甘蓝型油菜品系Westar,并得到T2代阳性转基因苗。对以上获得的阳性转基因材料进行表型观察、木质素总量和木质素单体等化学组分的测定、解剖学层面的观察和分析、菌核病抗性鉴定和抗折力测定。主要研究结果如下:1、BnF5H-1基因主要定位在细胞膜上,BnNST3-2是一个转录激活因子。2、BnF5H-1、BnNST3-2超表达载体成功遗传转化甘蓝型油菜,并得到T2代阳性转基因植株。3、使用CRISPR/Cas9基因编辑技术对甘蓝型油菜BnF5H家族中的4个优势表达基因BnF5H-1、BnF5H-4、BnF5H-6、BnF5H-7进行编辑,结果显示CRISPR/Cas9系统引起的靶序列或靶序列前后序列处存在碱基的插入（+）或缺失（-）。其中,转基因株系L-7在第二个外显子sg RNA处有碱基的插入导致BnF5H-1,BnF5H-4,BnF5H-6和BnF5H-7的移码突变。为了检查后代中可遗传靶向诱变的稳定性,从F5H敲除转基因植株T2代中扩增17个单株的片段,发现编辑位点及编辑结果和T1代相同。这些结果表明Cas9-sg RNA成功地在甘蓝型油菜BnF5H基因中产生了可遗传的突变。4、对BnNST3-2超表达植株进行表型观察,发现与WT相比,BnNST3-2超表达植株出现种子发芽更快,植株整个生理期提前,比WT更早开花的现象。5、与WT相比,F5H敲除转基因植株总木质素含量比WT低。35S:NST3-2超表达转基因植株总木质素含量比WT高,而35S:F5H-1超表达转基因植株总木质素含量和WT无明显差异。采用2D-HSQC-NMR法测定了T2代WT和F5H敲除转基因植株全细胞壁样品及木质素样品中木质素各单体之间的含量,结果显示,与WT相比,F5H敲除转基因植株S型木质素含量明显低于WT植株,S/G含量明显低于WT植株。6、Phloroglucinol-HCl染色转基因植株三个主要木质化器官,木质素总量无明显的变化。Maüle组织化学染色结果显示,在根和茎中,WT植物的纤维束间纤维及木质部被染成红色,而F5H敲除转基因植株纤维束间纤维及木质部被染成棕褐色。成熟期角果冰冻切片染色结果显示,F5H敲除转基因植株内果皮层被染成棕色,而WT植株内果皮层被染成红色。35S:NST3-2超表达植株与35S:F5H-1超表达植株Maüle组织化学染色结果与WT相比,纤维束间纤维及木质部的染色并无明显的差异。7、幼苗期离体叶片及成熟期茎秆接种鉴定结果表明,BnF5H敲除转基因植株菌核病抗性水平较野生型Westar高。35S:NST3-2转基因植株菌核病抗性水平较野生型低,35S:F5H-1转基因植株菌核病抗性水平与野生型相比无显著性差异。说明改变木质素单体比例可以影响甘蓝型油菜对核盘菌的抗性,S/G比值越小,甘蓝型油菜对核盘菌的抗性越高。8、测定成熟期WT与转基因植株的抗折力,结果表明,与WT相比,BnF5H敲除转基因植株的抗折力明显强。说明改变木质素单体比例可以影响甘蓝型油菜茎秆的抗折力,S/G越小,植株抗折力越强。