论文部分内容阅读
目的:1.以氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)为研究靶点,通过人类肝脏切片免疫组化染色,研究APN与肝纤维化分期的关系以及以APN为靶点进行分子成像的可能性。2.通过APN的免疫组化染色结果与α-SMA的免疫组化染色结果进行分析,探讨作为肝纤维化病理学金标准的α-SMA与APN的相关性,为APN在肝纤维化中的作用机制提供理论基础。3.初步研究99mTc-HYNIC-NGR动物体内显像结果、生物学分布、代谢情况,提供99mTc-HYNIC-NGR最佳成像条件及扫描参数,制定99mTc-HYNIC-NGR的合成、标记和质控方案;为靶向APN和αvβ3的分子成像及靶向治疗奠定基础。4.应用99mTc-HYNIC-NGR靶向APN对正常大鼠和肝纤维化大鼠进行SPECT成像,研究99mTc-HYNIC-NGR在正常大鼠和肝纤维化大鼠的体内分布、药物代谢的分子差异,研究其在大鼠肝纤维化中的应用价值。方法:1.采用肝脏穿刺活检的病理组织切片(由中国医科大学病理科提供),按照病理诊断肝纤维化严重程度将其分组,使用抗APN抗体以及抗α-SMA抗体作为一抗,通过Leica Bond-Max全自动免疫组化机进行肝组织免疫组化染色,抗原修复后,磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。应用Image Pro Plus软件对染色结果进行平均光密度分析,通过HE染色法,确定肝纤维化的分期,研究APN在肝纤维化不同分期中的表达变化以及与α-SMA的关系。2.模型组大鼠使用硫代乙酰胺(TAA)腹腔注射法进行建模,模拟肝炎致肝纤维化病理,对照组使用注射用生理盐水进行腹腔注射。两组均选用同周龄、体重相似的雄性Wistar大鼠。3.在合成99mTc-HYNIC-NGR过程中,通过调整合成药物的浓度,如乙二胺乙二酸(EDDA)分别使用2-25mg/ml、三羟甲基甘氨酸(tricine)分别使用5-30mg/ml、Sn Cl2分别使用5-25mg/ml、2-10m Ci Na99mTc O4等,采用混合水浴法,水浴10min进行标记,得出最佳药物合成浓度。合成的药物通过薄层纸层析法(Thin-layer chromatography,TLC)确定其放射性化学纯度,最终确定化学反应的最佳条件。4.合成99mTc-HYNIC-NGR探针后,SPECT扫描前使用10%水合氯醛进行麻醉,通过鼠尾静脉注射,分别对正常组大鼠及肝纤维化组大鼠进行连续动态扫描,获取Wistar大鼠的SPECT的动态扫描图像,分别在大鼠主要脏器,如心、肝、肾等,进行感兴趣区(Regions of interest,ROI)勾画,得出1-30 min内99mTcHYNIC-NGR在动物体内的分布图像。5.量正常大鼠及肝纤维化组大鼠肝脏和心脏的放射性计数比值(Liver-to-heart ratios,L/H),将组间数据进行统计学分析,应用Mann-Whitney U检验研究两组间各时点大鼠肝脏对99mTc-HYNIC-NGR的摄取差异。结果:1.免疫组化染色结果显示APN的表达随着肝纤维化进展而增高,APN的表达与肝纤维化呈正相关。2.TLC验证99mTc-HYNIC-NGR最佳合成条件的各药物浓度分别为:EDDA(5mg/ml)、tricine(10mg/ml)、Sn Cl2(15mg/ml),利用2m Ci Na99mTc O4进行标记,合成药物的放射性化学纯度达95%。3.99mTc-HYNIC-NGR动物体内分布以肾代谢为主,在心脏的摄取稳定、摄取较低,肝脏的摄取有明显的摄取曲线,有助于其后续临床应用。4.SPECT图像显示肝损伤组图像的各时点L/H均较正常组大鼠高,两组间L/H在2、5min存在统计学差异(P<0.05)。结论:APN在肝纤维化切片中主要表达于肝细胞膜上,在汇管区多表达于新生毛细血管,在肝纤维化S1、S2期的表达阳性率低于早期肝硬化组。99mTc-HYNIC-NGR在动物体内分布以肾脏为主,可用于SPECT分子成像。99mTc-HYNIC-NGR的成功合成及靶向APN的SPECT成像具有评价大鼠肝纤维化的应用潜力。