第一部分基于GelMA构建三维血管网目的:人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）是构建组织工程人工血管最受欢迎的内皮细胞亚型,人表皮成纤维细胞（human derm fibroblast cells,HDFs）常作为辅助细胞,能够辅助内皮细胞形成新生血管。甲基丙烯酰化明胶（Gelatin Methacryloyl,GelMA）作为在明胶基础上进行改性的一种可光交联高分子,具有良好的生物相容性和可调控机械特性,常用于组织工程水凝胶支架的构建。课题组前期已经构建了基于GelMA的微血管网,但采用海藻酸钠（Alginate）中空管作为牺牲材料仅能构建条状GelMA-微血管网体系,其应用受限。本研究的目的是在进一步优化微血管网成网条件的基础上,以聚二甲基硅氧烷（PDMS）构建不同形状模具,从而实现基于GelMA-血管网的形状定制,并探究血管网形成过程中HUVECs与HDFs的相互作用。方法:（1）本研究通过制备Alginate中空管作为牺牲材料构建条状GelMA水凝胶成血管网体系,并通过活死染色法验证GelMA水凝胶的生物相容性。在条状GelMA水凝胶成血管网体系的基础上,对比不同交联时间和不同HUVECs与HDFs细胞比例对GelMA水凝胶培养体系成血管网的影响,确定最优的成血管网条件。（2）在上述实验确定的最佳成网条件下,记录成血管网的过程中RFP-HUVECs与GFP-HDFs的细胞形态、细胞间相互作用。此外,将RFP-HUVECs和HDFs共培养,探究成网过程中细胞的基因表达。（3）制备不同形状的PDMS模具,将GelMA水凝胶注入模具中,在光交联后得到不同形状的GelMA水凝胶。在最佳成网条件下,构建圆形片状GelMA-微血管网体系,观察不同形状规格对体系成血管网的影响,并进一步验证上述实验得出的最佳成网条件。结果:（1）本研究应用Alginate制成的中空管作为牺牲材料,完成条状GelMA水凝胶成血管网体系的构建。40s实验组成网效果最佳。HDFs的加入对HUVECs在GelMA水凝胶中的成血管有促进作用。且当HUVECs与HDFs比例为2:1时,有最强促进成网作用。Calcein-AM/PI双染法结果显示,在第1、4、7和10天四个时间点,HUVECs细胞活力都大于95%,提示GelMA水凝胶拥有良好的生物相容性。（2）在GelMA水凝胶中HUVECs与HDFs之间相互作用研究中,我们发现细胞比例为2:1组能明显观察RFP-HUVECs与GFP-HDFs彼此联结,共同成网。免疫荧光结果显示,在共培养第7天时,表达VE-cad的细胞要多于RFP-HUVECs,且表达VE-cad的细胞能够与RFP-HUVECs彼此交融且共同形成类血管样网状结构。（3）应用PDMS模具能够制得的六边形、正方形、三角形和圆形片状GelMA水凝胶,实现水凝胶形状定制。HUVECs与HDFs在片状GelMA水凝胶中能够形成成熟的血管网,在第4、7和10天时,2:1组形成血管网状结构显著多于1:0组。结论:（1）GelMA水凝胶拥有良好的生物相容性,HDFs的加入对HUVECs在条状GelMA水凝胶中的成血管有促进作用,确定成血管网的最佳条件为40s交联时间、HUVECs与HDFs比例为2:1。（2）在HUVECs与HDFs混合GelMA水凝胶体系的形成血管网过程中,相较于HUVECs,HDFs能够更早拉伸并辅助HUVECs共同形成血管网,且二者在此过程中彼此融合,相互联结。（3）通过PDMS模具能够实现水凝胶形状定制,从而适应不同实验需求。第二部分去铁胺（DFO）对血管网形成的影响目的:本研究拟筛选一种生物小分子药物应用于促进HUVECs混合GelMA水凝胶体系的成血管网功能。DFO是提取于海洋植物中的一种多糖,可通过模拟体内缺氧环境,提高HIF-1α含量,从而促进VEGF等因子的分泌,发挥促血管生成作用。故本研究探索DFO对HUVECs增殖能力、迁移能力及成血管倾向等行为的影响,并验证DFO对HUVECs成血管相关基因（HIF-1α和VEGF）表达的影响和DFO对处于GelMA水凝胶体系中的HUVECs成血管能力影响。方法:（1）本研究采用CCK-8法表征不同浓度DFO对HUVECs增殖能力的影响。实验组加入不同浓度DFO的HUVECs完全培养基,对照组的完全培养基不添加DFO。应用CCK-8法检测细胞的相对数量。从而筛选出对HUVECs增殖能力无影响的DFO浓度。（2）基于CCK-8实验结果,通过Transwell小室实验确定不同浓度DFO对HUVECs迁移能力的影响,通过Matrigel成血管实验确定不同浓度DFO对HUVECs成血管倾向的影响,以确定促进HUVECs迁移和成血管倾向的最佳DFO浓度。（3）通过Western-Blot和RT-q PCR实验研究最佳DFO浓度对HUVECs成血管相关基因（HIF-1α和VEGF）RNA水平和蛋白水平表达的影响,并进一步分析该浓度DFO对处于GelMA水凝胶体系中的HUVECs成血管能力影响。结果:（1）通过分析CCK-8法实验结果发现,相较于对照组（Control）,当DFO浓度≥8μM时,DFO对HUVECs具有显著的增殖毒性,而当DFO浓度≤4μM时,未观察到显著的增殖毒性。因此,剔除DFO浓度为8、16和32μM的3个组别,仅保留DFO浓度为0.5、1、2、4μM的4个实验组和不添加DFO的对照组共5个组别进行后续实验。（2）通过分析Transwell小室和Matrigel成血管实验结果发现,当DFO浓度为2μM时,从Transwell滤膜上表面迁移至下表面的HUVECs细胞数量最多,且该条件下HUVECs在Matrigel表面的成网效果最优。（3）通过分析RT-q PCR和Western-Blot实验结果发现,当DFO浓度为2μM时,能够上调HUVECs成血管相关基因（HIF-1α和VEGF）RNA水平的表达;并且上调HIF-1α在蛋白水平上的表达。分析2μM DFO对处于GelMA水凝胶体系中的HUVECs成血管能力影响的实验结果发现,2μM DFO能够显著促进处于GelMA水凝胶体系中的HUVECs成血管作用。结论:DFO能促进血管生成,其机制涉及上调HIF-1α、VEGF表达,促进内皮细胞迁移。第三部分血管网化多孔PLGA管的构建目的:PLGA常作为组织工程支架材料,也有报道构建多孔PLGA管作为人工血管。人工血管的管腔内皮化并不是由血液中的内皮祖细胞粘附形成,也不是由宿主血管从吻合端爬行而形成,主要是通过宿主组织中的血管跨壁进入管腔而形成。为加快管腔内皮形成,本研究在PLGA孔隙中灌注GelMA和成血管相关细胞,旨在形成PLGA孔隙内血管网,可以迅速与宿主血管吻合,尽快实现管腔内皮化。方法:（1）通过盐析法应用粒径154-200μm的Na Cl盐粒作为牺牲材料制备PLGA多孔管状支架。观察支架的宏观结构,并使用扫描电子显微镜观察支架微观形貌。（2）将RFP-HUVECs与GFP-HDFs以细胞密度比例为1:0和2:1与GelMA混合后对PLGA多孔管状支架进行灌注。通过激光共聚焦显微镜观察RFP-HUVECs与GFP-HDFs在该体系中的生长情况和相互作用。结果:（1）PLGA多孔管状支架的颜色为白色,长度约为1.7cm,内径约为2mm,壁厚约为1mm。PLGA支架具备高孔隙率,且孔隙之间彼此连通。（2）在该体系中,相较于HUVECs,HDFs能够更早拉伸并辅助HUVECs共同形成血管网。有趣的是,第1天时,1:0和2:1组中的细胞均匀分布,但在第4、7和10天时,1:0组的细胞贴附于PLGA管壁,2:1组的RFP-HUVECs与GFP-HDFs既能贴附管壁成网又能在空腔中形成血管网,且随着时间的推移形成的血管网越发致密成熟。结论:多孔PLGA管灌注含内皮细胞的GelMA凝胶后,内皮细胞大量贴附于PLGA管壁。在凝胶体系中加入成纤维细胞后,PLGA孔隙中可形成血管网状结构。第四部分三维血管微环境与胶质瘤细胞球的相互影响目的:肿瘤组织中大多含有丰富的血管网,肿瘤细胞与血管微环境有着复杂的相互作用。肿瘤的生长发育与血管网密切相关。一方面,血管微环境对肿瘤细胞的生长、侵袭和转移起着重要作用,血管微环境能够在组织和细胞水平起作用,进行局部氧气和营养物质的交换。另一方面,肿瘤细胞对血管的形成也有着重要的影响。细胞球是多细胞共同组成的细胞聚集体,有相关报道称细胞球能够更好模拟机体细胞存在状态。本研究将U87胶质瘤细胞球与基于GelMA构建的微血管体系共培养,旨在探究血管微环境与U87胶质瘤细胞球之间的相互影响,并为后期基于此构建肿瘤药物筛选平台奠定基础。方法:（1）实验组将U87胶质瘤细胞球与三维微血管体系（HUVECs与HDFs在GelMA水凝胶中共同形成血管网）共培养,同时设置只含微血管网的GelMA水凝胶的组别以及只含U87胶质瘤细胞球的GelMA水凝胶的组别,观察并记录血管网形成情况和U87细胞球形态。（2）应用Cell Titer-Glo（?）3D试剂计算出抗肿瘤药物紫草素作用U87细胞24h的IC50浓度。实验组将含有HUVECs和HDFs的GelMA培养7天至形成成熟血管网时,将U87胶质瘤细胞球接种于其表面,对照组的U87细胞球铺种于不含管网的GelMA水凝胶表面。稳定12h后,两组均加入含IC50浓度紫草素的完全培养基继续培养24h。药物作用24h后,应用活死染色来表征U87细胞生存情况。结果:（1）实验结果显示,U87胶质瘤细胞球和微血管网共培养的实验组所形成的血管网更为稀疏,且U87胶质瘤细胞球周围的HDFs未出现明显聚集;细胞球更加凝实,U87细胞未发生明显迁移。提示当U87胶质瘤细胞球在三维血管微环境中培养时,该体系的成血管能力受到抑制,与此同时U87细胞球的迁移能力也受到抑制。（2）通过Cell Titer-Glo（?）3D试剂计算出紫草素作用24 h的IC50浓度为13.08μM。接种在含成熟微血管网GelMA水凝胶表面的U87胶质瘤细胞球的细胞存活率高于对照组U87胶质瘤细胞球。提示血管微环境能够提高U87胶质瘤细胞对于抗肿瘤药物紫草素的耐受性。结论:（1）胶质瘤细胞系U87可抑制血管网生成,U87细胞也未对HDFs产生趋化作用,提示U87可抑制血管网生成但不涉及成纤维细胞趋化作用;（2）血管网可提高胶质瘤细胞系U87对抗肿瘤药物紫草素的耐受性。