【摘 要】
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目的:胎儿生长受限（fetal growth restriction,FGR）损伤子代个体胚胎期肾脏发育,继发成年期肥胖、高血压、糖尿病等代谢综合征。课题组前期研究发现:FGR大鼠子代胚胎20天（E20）肾脏组织中,初级纤毛关键组成因子（Dynlt1）表达明显降低,经典Wnt/β-catanin信号通路受到抑制。本课题研究围绕FGR个体肾脏疾病和高血压易感性增加的胎儿起源机制,以FGR大鼠模型和H
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.81971400）；
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目的:胎儿生长受限（fetal growth restriction,FGR）损伤子代个体胚胎期肾脏发育,继发成年期肥胖、高血压、糖尿病等代谢综合征。课题组前期研究发现:FGR大鼠子代胚胎20天（E20）肾脏组织中,初级纤毛关键组成因子（Dynlt1）表达明显降低,经典Wnt/β-catanin信号通路受到抑制。本课题研究围绕FGR个体肾脏疾病和高血压易感性增加的胎儿起源机制,以FGR大鼠模型和HK2细胞模型为基础,研究Dynlt1调控经典Wnt/β-catanin信号通路活性的作用机制,以及对HK2细胞自噬、凋亡和增殖等生物学行为的影响。方法:1、FGR大鼠模型建立:应用孕期低蛋白饮食法建立FGR大鼠模型。选取成熟未育的Wistar雌性大鼠（体重230-250g）,Wistar雄性大鼠（体重260g-330g）。记录雌鼠初始体重,雌雄鼠分笼适应性饲养一周。按照雌性:雄性=4:1比例选取适宜大鼠夜间合笼,次日早8:00行阴道分泌物涂片镜检,发现精子记为胚胎第0天（E0）,并将孕鼠随机分组。未受孕雌鼠继续按此方法合笼直至受孕。实验组（FGR组）予以蛋白含量约为7%的低蛋白饮食直至子代胚胎20天（E20）取材;对照组（CON组）给予蛋白含量约21%的正常饮食直至子代胚胎20天（E20）取材。两组均给予充足饮水,记录喂养期间各组大鼠体重变化情况,于子代胚胎20天（E20）取材进行标本收集,每组至少取10只胎鼠肾脏组织用生理盐水冲洗干净于-80℃深冻冰箱冷冻保存。2、FGR组纤毛相关蛋白表达变化:采用q RT-PCR方法检测FGR大鼠子代胚胎20天（E20）纤毛相关蛋白（Dynlt1、Ift88、Ift80、Bbip）表达差异,用蛋白质免疫印迹（Western Blot）、免疫组化方法检测大鼠子代胚胎20天（E20）肾脏Dynlt1蛋白表达差异。3、HK2细胞模型构建:以HK2细胞作为细胞模型,分别转染Si-Dynlt1和Si-NC作为实验组（Si-Dynlt1组）和对照组（Si-NC组）,以未处理的HK2细胞作为空白组（Blank组）。4、Si-Dynlt1组HK2细胞纤毛相关因子及Wnt通路变化:采用Western Blot、免疫荧光等方法检测HK2细胞Dynlt1转染效率,检测HK2细胞Dynlt1表达下调后纤毛相关因子（Ift88、Ift80）及经典Wnt信号通路相关关键因子（β-catenin、p-β-catenin、Gsk3β、p-Gsk3β、Axin2等）表达差异情况。5、Si-Dynlt1组HK2细胞凋亡、自噬、增殖相关蛋白表达水平检测:采用流式细胞术、Western Blot、免疫荧光和CCK8法等方法观察下调Dynlt1蛋白表达对细胞凋亡调控因子（Caspase3、Caspase8、Bcl-2、Bax）、自噬蛋白标志物（Lc3b、P62、Beclin1）、细胞增殖等的影响。结果:1、E20天时FGR子鼠肾脏多种纤毛相关蛋白表达异常:根据E20胎鼠肾脏组织q RT-PCR检测结果,FGR组子鼠在E20天纤毛相关因子Ift88表达显著升高（P＜0.01）,Dynlt1、Bbip表达明显下调（P＜0.05）,Ift80表达有升高趋势（P＞0.05）。Western Blot、免疫荧光结果验证FGR子鼠在E20出现肾内Dynlt1蛋白表达明显降低。2、Si-Dynlt1组HK2细胞纤毛相关蛋白表达异常,Wnt通路受到抑制:下调HK2细胞Dynlt1蛋白表达后,WB及免疫荧光结果显示Ift88、Ift80表达升高,纤毛结构显著延长;p-Gsk3β表达水平增加,细胞β-catenin蛋白磷酸化增多,入核减少,Axin2表达含量下降,提示Wnt/β-catenin经典信号通路受到抑制。3、凋亡调控因子、自噬相关标志物、增殖水平变化:流式细胞术结果显示HK2细胞Dynlt1表达下调后凋亡水平显著增加,WB结果显示Caspase3、8蛋白含量明显增加,Bcl-2含量减少。凋亡抑制剂Z-DEVD-FMK处理过的Si-Dynlt1组细胞凋亡水平下降,使用通路激活剂Licl可抑制Dynlt1敲减后诱导的细胞凋亡,提示Dynlt1下调导致的细胞凋亡与Wnt通路受到抑制有关。CCK8结果显示HK2细胞下调Dynlt1表达后增殖活性明显降低,P62蛋白含量减少、Lc3b和Beclin1表达增加,提示Si-Dynlt1组细胞增殖减少、自噬增加。结论:母鼠孕期蛋白营养不良导致FGR可引起子代胎鼠肾脏Dynlt1蛋白含量降低,初级纤毛结构改变长度增加,可抑制经典Wnt信号通路,导致β-catenin蛋白磷酸化水平异常增加,激活凋亡因子Caspase家族成员诱导细胞凋亡,促进细胞自噬,抑制细胞增殖。
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