水稻,作为重要的粮食作物,是全球超过一半以上人口生存的食物来源,深入了解水稻生长发育过程及调控具有重要的意义。结合目前多维液相色谱分析植物蛋白质组学的发展趋势,本论文建立二维液相色谱和三维液相色谱串联质谱技术,以灌浆期的水稻叶片为实验材料,通过优化多维液相色谱的流动相酸碱度及馏分收集数目等参数,旨在建立正交性高、分离度好的多维液相色谱串联质谱技术分析水稻叶片蛋白质组学。实验主要研究成果包括如下:1.本实验建立了离线亲水作用-反相二维液相色谱结合馏分收集技术分析水稻叶片蛋白质。通过考察亲水作用色谱和反相色谱流动相的酸碱度对系统正交性的影响,得到如下结论:亲水作用色谱(pH 9.3)和反相色谱(pH 3.3)的条件下结合可实现较好正交性R~2=0.34113,并且该方法在实际水稻叶片蛋白质分析中也表现出较好的正交性和分离能力。2.分别优化了二维液相色谱系统中馏分收集数目和一维液相色谱粗肽段上样量等参数。实验从鉴定蛋白质数目、蛋白物理化学性质等方面考察了馏分收集数目(12组、22组和42组)和一维液相色谱粗肽段上样量(2 mg、4 mg和6 mg)对水稻叶片蛋白质鉴定数目的影响。实验结果表明当馏分收集数目和一维液相色谱粗肽段上样量分别为22组和4 mg时鉴定蛋白质组数目最佳,共鉴定到3592个肽段,归属于2245个蛋白质组,二维液相色谱表现出高效、高通量的分析效果。3.本实验在二维液相色谱的基础上通过优化离子对-反相色谱离子对种类等参数考察系统正交性,实验结果表明当HFBA-RP作为一维液相色谱时,三维液相色谱系统正交性最佳分别为R~2=0.43139和R~2=0.66473,基于该实验结果建立了三维液相色谱串联质谱分析水稻叶片蛋白质。该方法应用到实际水稻叶片蛋白质分析表现出更高的分离能力和分辨率,该方法鉴定出46404个肽段,归属于6976个蛋白质组。相比于二维液相色谱,三维液相色谱多鉴定出2.85倍蛋白质组。