EGCG和BCAA预防成肌细胞缺氧损伤及其机理

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表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG)是茶叶中具有抗癌症,抗心脑血管疾病,抗氧化等生物活性且含量最高的儿茶素类化合物,其可减少骨骼肌萎缩,促进肌细胞分化;支链氨基酸(Branched chain amino acids,BCAA)作为人体的必需氨基酸具有提升蛋白质合成率,调节肌肉量等作用,在调节细胞能量吸收,抑制自由基形成,使成肌细胞免于饥饿死亡等方面具有显著活性。大量研究表明EGCG和BCAA对成肌细胞活性表现出有益作用,但目前为止,EGCG和BCAA对缺氧状态的细胞是否具有保护作用报道较少。因此,本研究主要针对EGCG或BCAA预防骨骼肌成肌细胞缺氧损伤的效应及其作用机理进行研究。(1)研究了EGCG和BCAA预处理(24 h)对成肌细胞低氧损伤(O2浓度1.0%,处理48 h)的保护效果。结果表明,EGCG和BCAA具有较好保护缺氧损伤骨骼肌成肌细胞的效果,当EGCG和BCAA浓度分别20μM、20 m M时保护效果最好,低氧培养后C2C12活力可达正常培养对照组的99.3%、89.4%。(2)利用Western blot、qRT-PCR(Quantitative Real-time PCR)实验,对经EGCG或BCAA预处理的成肌细胞死亡相关蛋白及基因表达进行了研究。结果表明,EGCG预处理24 h的成肌细胞与对照组相比,其LC3A/B(Anti-LC3A/B)降低53.8%、mTOR(mammalian target of rapamycin)升高33.0%、AMPK(Adenosine 5‘-monophosphate(AMP)-activated protein kinase)降低82.4%。当受到低氧胁迫时,EGCG的预处理使ULK-1(unc-51-like kinase 1)降低69.5%、AMPK降低139.4%、mTOR显著升高281.9%。自噬相关的基因Atg5、Becline1、ulk-1也较对照组降低100.0%、145.0%、549.1%的效果;BCAA预处理24 h的成肌细胞与对照组相比,其PARP(Poly ADP-ribose polymerase)降低61.7%、AMPK降低92.4%、mTOR升高577.8%。在受到缺氧损伤后,BCAA的预处理使Caspase 3(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3)降低61.6%、Caspase 9(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3)降低63.6%、AMPK降低48.1%、mTOR升高324.0%。而凋亡相关的基因Chop、Bax以及Bcl2表现出降低252.8%、降低141%及升高132.8%的表达量。由此判断EGCG和BCAA预防骨骼肌成肌细胞的缺氧损伤分别作用在细胞自噬和凋亡通路上。其次,分别对EGCG和BCAA预处理的成肌细胞进行了自噬或凋亡诱导实验,结果显示,低氧胁迫后自噬或凋亡诱导剂对EGCG和BCAA预处理过的成肌细胞分别降低了41.9%、36.3%的细胞相对活力,与对照组持平,进一步证实了EGCG和BCAA分别作用在自噬与凋亡通路上。(3)研究了EGCG-BCAA与酪蛋白形成的纳米复合物,对预防成肌细胞缺氧损伤的增效作用,结果表明纳米复合物预防成肌细胞缺氧损伤的效果较非纳米化的EGCG-BCAA溶液效果提升16.5%。分析表明,纳米复合物的作用效果可能与其粒径更适合于成肌细胞吸收有关。该研究对于寻找有效维持机体骨骼肌稳态,缓解大运动量或高海拔环境带来的机体低氧损伤,减缓应激环境下骨骼肌成肌细胞的死亡具有重要的实际应用意义,可为研发相关的健康食品提供理论支撑。
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