背景和目的据美国癌症协会统计,前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤,并且是男性癌症死亡的第二大原因。数据表明,10-20%的前列腺癌患者在随访的5年内出现去势抵抗性前列腺癌,并且自出现去势抵抗以来的中位生存期约为14个月（范围10-30个月）。此外,非转移性CRPC患者有更高的疾病进展风险。大约有15–33%的患者在2年内发生转移,并且其中超过80%的病例会累及骨骼,显著增加了该人群的死亡率。因此了解它的转移机制是推进治疗的重要一步。骨桥蛋白（osteopontin,OPN）也被称为分泌型磷蛋白I（secrected phosphoprotein 1,SPP1）,是一种糖基化的磷酸蛋白,由SPP1基因编码,在体内多种组织中表达。近年来,越来越多的证据表明,骨桥蛋白的异常表达与肿瘤的发生、发展密切相关,尤其与多种肿瘤的转移密切相关。因此,它代表了癌症治疗最吸引人的靶点之一,在我们之前的研究中,我们发现SPP1是预测前列腺癌骨转移发展的潜在中心信号。在此,我们整合了高通量基因表达（Gene Expression Omnibus,GEO）数据库来探索SPP1的表达与前列腺癌骨转移之间的关系,并研究了SPP1在前列腺癌组织和高转移高侵袭性前列腺癌细胞系中的表达。接下来,我们建立了SPP1基因敲除的前列腺癌细胞系,研究SPP1对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并进一步探讨其潜在的调控机制。生物信息学分析、实时荧光定量PCR和Western blot结果表明,SPP1表达上调与骨转移性前列腺癌的恶性进展密切相关。此外,SPP1基因敲除抑制了前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移的能力。总体而言,我们的发现揭示了SPP1在前列腺癌进展中起着重要的作用,我们的结果有助于发现针对前列腺癌骨转移的新的潜在靶点。方法1.差异表达基因筛选:从公共数据库NCBI-GEO下载前列腺癌芯片数据,并使用R中的生物信息学开源软件对下载的数据处理包进行归一化。应用“limma”软件包对原发性前列腺癌与骨转移前列腺癌样本中差异表达基因进行鉴定。2.验证差异表达基因SPP1在不同组织和细胞中的表达水平:使用q PCR和WB检测正常前列腺上皮细胞和高转移高侵袭性前列腺癌细胞株中SPP1的m RNA和蛋白的表达水平。3.构建CRISPR/Cas9表达载体和报告载体:设计合成sgRNA以及报告序列,分别连接到PX330质粒和pm Cherry-C1-EGFP（N1）质粒中。测序鉴定成功后转染PC-3细胞,转染48小时后,使用流式分选仪分选出所需要的的目的细胞。4.单克隆基因敲除细胞株的筛选与鉴定:通过细胞计数,然后进行96孔板铺板,使每个孔中含有一个细胞,待细胞贴壁后寻找只有单个细胞的孔,做好标记,精心呵护,待单克隆细胞长起来后提取基因组DNA,并在靶点上下游处设计引物进行PCR扩增,并将扩增产物送测序来鉴别单克隆细胞的基因组上的敲除情况。5.验证SPP1基因敲除对前列腺癌细胞功能的影响:采用克隆形成实验、EdU细胞增殖检测实验以及CCK8增殖实验来检测SPP1基因敲除对前列腺癌细胞增殖功能的影响;采用细胞划痕实验以及Transwell小室实验检测SPP1基因敲除对前列腺癌细胞迁移能力的影响;通过对Transwell上室铺被基质胶的方法检测SPP1基因敲除对前列腺癌细胞侵袭能力的影响。结果1.使用R中的“limma”软件包对GSE32269数据集和GSE77930数据集中的数据进行分析,设置阈值为p＜0.05和|log~2FC|＞1,与原发性前列腺癌样本相比骨转移性前列腺癌样本在GSE32269中共发现2283个差异表达基因,而在GSE77930中共发现3396个差异表达基因,然后我们对两个数据集的差异表达基因进行比较,共有381个基因重叠,其中有325个共同上调基因,有56个共同下调基因。我们选择显著差异表达基因SPP1作为研究对象。2.与正常前列腺上皮细胞P69相比,雄激素非依赖性及高侵袭性和高转移性前列腺癌细胞PC-3和Du 145中SPP1在m RNA水平和蛋白水平上的表达显著增加。3.Sanger测序结果显示设计的sgRNA以及报告序列分别正确连入我们的PX330质粒和pm Cherry-C1-EGFP（N1）质粒载体当中,根据荧光结果来看,设计的报告序列正确可用。4.使用流式分选仪成功的分选出了目的细胞,细胞铺板后找到了只有单个细胞的孔,并且在后面的单克隆细胞挑选和鉴定过程中通过Sanger测序结果判断,我们成功的得到了SPP1基因敲除的单克隆细胞系。5.细胞功能学实验表明SPP1基因敲除能显著抑制PC-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结论SPP1在前列腺癌骨转移样本中高表达,通过CRISPR/Cas9敲除SPP1基因可以显著抑制PC-3细胞的增殖、迁移和侵袭能力,提示SPP1可能在前列腺癌进展过程中具有重要作用。