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目的白细胞介素13（Interleukin-13,IL-13）为Th2细胞分泌的细胞因子,参与器官纤维化、炎症和肿瘤的发生和发展。有研究表明IL-13存在人乳腺癌组织中,人乳腺癌组织微环境常常呈现与Th2相关的炎症和纤维化并促进了肿瘤的发展,以高水平IL-13为代表的免疫平衡失调可能会导致肿瘤细胞的恶性生长选择。肿瘤所处的微环境对肿瘤的发生发展起重要作用,成纤维细胞是该微环境中最主要的基质细胞,它通过直接的细胞接触、分泌信息分子与微环境中的各组成成分发生交互作用,对癌变细胞的生长起着沃土或蓄电池（battery-operated tumor growth）的作用。本文研究了在人乳腺癌细胞与人成纤维细胞共培养条件下IL-13对抗凋亡因子B-cell lymphoma-2（Bcl-2）和Tp53-induced glycolysis and apoptosis regulator（TIGAR）及自噬体的影响,试图探索IL-13对乳腺癌作用的分子机制。方法1.细胞培养将解冻的细胞放入含10%胎牛血清的DMEM-H培养液中,37℃,5%CO2,维持饱和湿度。共培养采用培养板和Transwell insert,根据实验要求接种人乳腺癌细胞BT-474和人成纤维细胞ESF,两种细胞不互混,通过同一培养液相互影响。根据实验要求加入IL-13（50ng/mL）。2.RT-qPCR实验Trizol-离心柱法提取细胞总RNA,以相应溶剂为空白对照,取2μL RNA溶液放于Merinton SMA4000仪器检测,观察A260/A280、A260/A230比值及连续波长吸收峰,并计算RNA溶液浓度,判断RNA提取质量,A260/A280>2.0且<2.3,则可以满足后续RT-qPCR所需。3.Western blot实验加入裂解液,4℃,裂解细胞30min,收集细胞,-80℃保存。BCA法测定蛋白浓度,根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。加入等量蛋白进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,入含5%脱脂奶粉-0.05%tween-20/TBS封闭液中封闭。孵育一抗,4℃,过夜。洗膜后将膜移到含二抗的玻璃平皿中,室温,1-2 h。ECL发光显影,Image J软件分析电泳条带光密度。4.MDC染色和激光共聚焦显微镜实验去除培养基,4%多聚甲醛固定爬片上的细胞,PBS洗涤细胞,MDC染色标记细胞自噬体,加入50μmol/L MDC-PBS溶液覆盖细胞,37°C,避光孵育30min,PBS漂洗后在激光共聚焦显微镜下观察、拍照,Image-Pro Plus软件分析各组荧光强度。5.细胞凋亡实验Annexin V每一实验样本细胞数量为5×105,用生物素-Annexin V孵育细胞15 min,再用PE-链霉亲和素孵育细胞5 min。流式细胞仪检测细胞前,加入7-amino-actinomycin（7-AAD）用于区别凋亡细胞与其他死细胞。6.细胞增殖实验CCK8在24孔板中,每孔加入800μL的BT-474细胞悬液,每个Transwell insert中加入ESF细胞悬液,细胞浓度为4×104/mL,共培养的ESF细胞与BT-474细胞的最终数量比为4:1,设空白孔,每组设5个复孔,培养24h、48h、72h、96h和120h后,依据CCK-8 Kit说明书,各测试孔加入20μL CCK-8溶液,培养箱内孵育1-3小时,从每份样品中取100μL培养液至96孔板,酶标仪在450nm波长处测定OD值。7.统计学分析实验结果均以ⅹ±SD表示,用SPSS Statistics 17.0软件对实验数据进行分析,两组间比较采用t检验,P<0.05为差异有显著性,P>0.05为差异无显著性。结果1.IL-13上调了与人成纤维细胞ESF共培养的人乳腺癌细胞BT-474的抗凋亡因子Bcl-2和TIGAR的mRNA与其他各组比较,BT-474+ESF+IL-13组的BT-474细胞Bcl-2 mRNA的表达显著上调（P<0.05）,是BT-474组的2.20倍,是BT-474+ESF组的1.60倍,是BT-474+IL-13组的1.26倍;与其他各组比较,BT-474+ESF+IL-13组TIGAR mRNA的表达显著上调（P<0.05）,是BT-474组的2.40倍,是BT-474+ESF组的1.80倍,是BT-474+IL-13组1.30倍。2.IL-13上调了与人成纤维细胞ESF共培养的人乳腺癌细胞BT-474的抗凋亡因子Bcl-2和TIGAR的蛋白表达与其他各组比较,BT-474+ESF+IL-13组BT-474细胞TIGAR蛋白的表达显著上调（P<0.05）,是BT-474+ESF组的2.89倍,BT-474+IL-13组的1.60倍,BT-474组的3.50倍。与其他各组比较,BT-474+ESF+IL-13组BT-474细胞Bcl-2蛋白的表达显著上调（P<0.05）,是BT-474+ESF组的2.83倍,BT-474+IL-13组的1.51倍,BT-474组的2.13倍。这些结果与IL-13上调BT-474细胞抗凋亡因子TIGAR和Bcl-2 mRNA的结果相互印证。3.IL-13促进了与人乳腺癌细胞BT-474共培养的人成纤维细胞ESF的自噬体形成ESF+BT-474+IL-13组的ESF细胞自噬体荧光强度显著高于其他各组（P<0.05）,是ESF+BT-474组的1.86倍,ESF组的3.78倍,ESF+IL-13组的1.20倍。这些结果表明,IL-13对共培养的成纤维细胞的自噬体具有上调作用。4.IL-13通过上调Bcl-2、TIGAR和自噬体,抑制了人乳腺癌细胞BT-474的凋亡并促进BT-474细胞的增殖与BT-474+ESF共培养组比较,BT-474+ESF+IL13共培养组的早期调亡的BT-474细胞下降了10.85倍;与BT-474+IL-13组比较,BT-474+ESF+IL13共培养组的早期调亡的BT-474细胞下降了6.49倍;与BT-474组比较,BT-474+ESF+IL13共培养组的早期调亡的BT-474细胞下降了14.41倍。细胞增殖实验结果显示,培养后的24h各组BT-474细胞增殖无显著差异（P>0.05）,培养后的48h、72h、96h和120h后,将BT-474+ESF+IL-13组分别与各组比较,BT-474细胞增殖显著高于其它各组（P<0.05）。结论1.IL-13上调了人乳腺癌细胞BT-474抗凋亡因子Bcl-2和TIGAR的表达,成纤维细胞与乳腺癌细胞共培养能促进IL-13对Bcl-2和TIGAR的作用。2.IL-13促进了人成纤维细胞ESF自噬体的形成,乳腺癌细胞与成纤维细胞共培养能增强IL-13对自噬体的作用。3.IL-13通过上调人乳腺癌细胞BT-474抗凋亡因子Bcl-2和TIGAR的表达和促进人成纤维细胞ESF自噬体的形成,抑制了乳腺癌细胞的凋亡和促进了乳腺癌细胞的增殖。