静脉移植和经皮腔内血管成形术是目前治疗外周血管闭塞性疾病的主要方法，近年来随着治疗方法的日益完善和新材料、新设备的不断涌现，早期疗效有了明显的提高；但新内膜增生和血管重塑造成了约20～40％的患者术后再狭窄，严重阻碍了远期疗效。关于再狭窄的病理机制及预防、治疗对策的研究成为当今血管外科领域的重要课题。 再狭窄的发病机制尚未完全明了，目前认为损伤处VSMC的增殖和迁移是再狭窄的重要原因。有大量证据可支持生长因子作为关键的信号分子在血管成形术后有加速血管损伤的作用，许多病变特征可用已知的生长因子和细胞活素的特点进行解释。在这些生长因子中，bFGF作为强有丝分裂因子、弱化学趋化因子以及它转化细胞的能力，被认为在再狭窄病变中起着关键作用。 bFGF是成纤维细胞生长因子(FGF)家族成员之一，体内分布广泛，具有多种生物学活性。由于翻译起始位点不同，bFGF有4种异构体，在细胞内分布不尽相同。正常情况下VSMC是合成bFGF的主要血管壁细胞。含密码子AUG的bFGF基因编码低分子量bFGF(18000)，主要位于胞浆；而含密码子CUG的bFGF基因编码高分子量bFGF(22000、22500、24000)，主要位于胞核。 目前，国内有关bFGF与VSMC增殖关系的研究，已有少量报道，尚不充分。基于此点，本课题利用反义核酸技术，通过RT-PCR、Western Blotting半定量和原位杂交、免疫组化等定性方法，对bFGF与VSMC增殖之间的关系进行了较为系统的研究。 第一章：大鼠血管平滑肌细胞原代培养的建立及鉴定 本研究取Wistar大鼠胸主动脉，以贴块法在10％FBS-DMEM培养基内行VSMC原代培养，并适时传代，取4～7代作为实验材料。在传代培养中，未融合时，细胞表现为合成型(未分化型)，生长旺盛，有时可呈现不规则圆形或多边形；当SMC融合时，表现为收缩型(分化型)可见到平滑肌细胞典型的生长形式即细胞呈梭形，平行生长，束状排列，密集与稀疏处相互交错呈“峰天净居祥大李葫毖老戈，谷”状。经平滑肌细胞特异性标志物a一actin免疫细胞化学鉴定，证明培养细胞是平滑肌细胞。，本研究采用体外培养的大鼠主动脉中膜SMC来模拟再狭窄病变过程中增殖的SMC，这也是当前体外研究血管疾病通用的方法。所以，我们认为此实验模型是可行的。 第二章:VSMc中bFGF及其受体FGFR一1的基因表达 本实验以传代培养的VSMC作为实验材料，使用原位杂交技术检测了bFGF及其受体FGFR一1的毗NA表达，结果显示均有高水平表达:使用免疫细胞化学方法检测了bFGF在VSMC中的蛋白表达，结果表达阳性。由此可见，传代培养的大鼠vSMC表达bFGF及受体FGFR一1，提示在Vs毗中bFGF是自分泌因子，其部分活性可能是通过自分泌方式实现的。 第三章:bFGF反义寡核昔酸体外抑制VSMC增殖的研究 前述实验证实大鼠VSMC表达bFGF基因，其活性是通过自分泌方式实现的。提示将bFGF作为基因治疗靶点，封闭其表达有可能抑制VS毗的增殖。反义寡核普酸技术是基因治疗的主要手段之一。反义寡核普酸技术是指用人工合成的寡核昔酸链，与靶基因某一特定序列进行互补结合，通过空间位阻效应或诱导RNaseH的活性或通过与DNA形成三聚体等作用而抑制靶基因的方法。本研究采用反义ODN进行体外抑制VS脱增殖的实验，合成了三条寡核昔酸即bFGF mRNA AODN、SODN和RODN。使用硫代磷酸化修饰以增加ODN的稳定性，应用脂质体为介导进行转染。设AODN为实验组，以soDN、RODN、脂质体和空白组为对照组，用RT一PCR、Western Blotting方法分别在RNA、蛋白水平检测bFGF基因表达，用价T法检测ODN干预后的细胞存活率。结果如下: 1 .RT一PCR半定量分析:用RT一PCR技术检测转染5 p M ODN后vsMC bFGF.RNA的表达，反义组显著降低，同对照组相比差异有显著性，而对照组之间无明显差异。这说明bFGF AODN抑制了其基因表达。天单医弃义李曰士落戈. 2.舵stern Blotting半定量分析:用蛋白印迹技术检测转染5 p M ODN后vS珊bFGF蛋白表达，反义组显著降低，同对照组相比差异有显著性，而对照组之间无明显差异。这说明bFGF AODN抑制了其蛋白表达。 3.细胞存活率:用M了T法检测转染ODN后vSMC存活率，反义组1 pM时无作用，3 pM出现抑制作用，10 pM时效果最明显，表明AODN对细胞存活率的影响是剂量依赖性的;转染1一2天，抑制细胞增殖作用最强，2天后开始减弱，第5天，存活率己接近对照组。SODN和RODN转染细胞，在高浓度时，对细胞存活率也有短暂轻微抑制，但同AODN组相比，差异显著，这说明高浓度SODN和RODN抑制细胞增殖的机制不同于AODN。 总之，通过以上实验我们得出以下结论: 1.大鼠血管平滑肌细胞表达bFGF和其主要受体FGFR一1，说明了bFGF自分泌环在大鼠VS枕增殖中的作用。 2.bFGF反义ODN转染yS成，bFGF mRNA表达和蛋白表达明显减少，而对照组正义、随机、脂质体和空白对照的bPGF mRNA表达和蛋白表达无改变，表明bFGF反义ODN对bFGF基因表达有明显的、特异性的抑制作用。 3.bFGF反义ODN可明显抑制大