目的帕金森病作为全球第二大神经退行性疾病,目前尚没有安全且有效的治疗方式。作为帕金森病常用的补充治疗方式之一,针刺治疗,尤其是单一穴位针刺治疗的效果及其潜在作用机制仍存在争议。合谷穴作为帕金森病治疗中的常选穴位之一,单独使用时的作用与相关机制并不明确。许多研究认为电针刺激合谷穴影响交感神经活性,但合谷穴参与帕金森病的治疗过程是否也通过交感神经起作用目前尚无确切的证据。所以我们拟通过本实验解决两个主要问题:1.电针刺激合谷穴在帕金森病小鼠模型中是否具有治疗效果;2.电针刺激合谷穴是否通过影响腹腔交感神经活性参与帕金森病的调节。以期为电针刺激合谷穴这一单一穴位在帕金森病中的治疗效果及其潜在机制提供基础实验证据,为临床针刺治疗帕金森病提供神经生物学理论支持及新的治疗思路。方法第一部分本部分实验拟构建MPTP（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶）亚急性帕金森病小鼠模型,选择1 m A和3 m A两种不同强度电针刺激合谷穴,通过对比运动相关行为学实验（爬杆、悬挂、转棒）测定结果探寻电针刺激合谷穴这一单一穴位对帕金森病模型小鼠的运动障碍是否具有治疗效果;通过对比情绪（旷场）及认知相关的行为学（Y型迷宫自主交替实验和新物体识别实验）实验结果,探究电针刺激合谷穴对于帕金森病模型小鼠的情绪及认知障碍是否具有治疗效果;最后通过中脑黑质区域TH（tyrosine hydroxylase,酪氨酸羟化酶）和IBA-1（ionized calcium binding adapter molecule 1小胶质细胞/巨噬细胞特异性蛋白抗体）免疫荧光染色观察电针刺激合谷穴对中枢多巴胺能神经元和小胶质细胞的影响。1.实验小鼠分为5组:对照组、MPTP模型组、MPTP+假针组、MPTP+电针1 m A组和MPTP+电针3 m A组。实验前对所有小鼠进行3天的爬杆、悬挂和转棒行为学训练,使用MPTP腹腔注射7天诱导亚急性帕金森病模型,造模结束后在小鼠的双侧合谷穴进行连续5天不同强度的（分为1 m A和3 m A）电针干预,干预结束后进行运动相关行为学（爬杆、悬挂、转棒）、情绪（旷场实验）及认知相关行为学（Y型迷宫自发交替实验、新物体识别实验）测试分析。2.采用免疫荧光法进行对照组、MPTP模型组和MPTP+电针3 m A组3组小鼠中脑黑质区域的多巴胺能神经元（TH）和小胶质细胞（IBA-1）免疫荧光染色,统计3组小鼠黑质致密区域多巴胺能神经元数量以及小胶质细胞数量。第二部分在实验一部分探究了3 m A电针刺激合谷穴对于MPTP诱导的帕金森病模型小鼠运动障碍及非运动症状的治疗作用之后,本部分实验拟构建腹腔交感神经节损毁小鼠模型,通过合谷穴伪狂犬病毒示踪、肠道菌群16s测序分析以及3 m A电针刺激合谷穴后脑区内c-fos蛋白的表达情况,探究合谷穴相关的微生物-肠-脑轴神经调控机制。1.在第一部分实验的基础上,收集对照组、MPTP模型组和MPTP+电针3 m A组小鼠粪便进行16s测序分析,对比MPTP+电针3 m A组小鼠和MPTP模型组小鼠粪便菌群组成在科水平上前十位的差异菌A组。2.选取5只小鼠进行腹腔交感神经节损毁术,并在腹腔交感神经节损毁小鼠模型的基础上,构建MPTP腹腔注射7天诱导的亚急性帕金森病模型,收集小鼠粪便进行16s测序分析,对比第一部分实验中MPTP模型组小鼠和腹腔交感神经节损毁+MPTP组小鼠粪便菌群组成在科水平上前十位的差异菌B组。3.对比差异菌A组和差异菌B组之间是否存在相同的差异菌群。4.在合谷穴进行伪狂犬病毒注射逆行示踪,找出合谷穴在中枢的上游神经元投射。5.选取未经处理的C57BL/6J小鼠分为三组:对照组（n=3）、电针3 m A组（n=3）和腹腔神经节损毁+电针3 m A组（n=3）,先对腹腔神经节损毁+电针3 m A组小鼠进行腹腔神经节损毁手术,其余2组进行腹腔假手术,恢复2周后,3组小鼠同时进行合谷穴3 m A电针刺激,统计蓝斑区域内c-fos荧光蛋白的表达差异。第三部分由于第一部分实验进行了合谷穴治疗效果的探究,第二部分实验对腹腔交感神经节参与的微生物-肠-脑轴相关神经调控机制进行了探究,本部分实验拟构建不同药物诱导的帕金森病小鼠模型,对腹腔神经节参与的合谷穴治疗帕金森病的作用机制进行功能性验证实验研究。1.小鼠分为2组:假手术+MPTP组和腹腔交感神经节损毁手术+MPTP组。对所有实验小鼠进行为期3天的爬杆、悬挂和转棒行为学训练,然后分别对两组小鼠进行腹腔交感神经节损毁手术和腹腔神经节假手术,术后恢复2周。测定两组小鼠的运动基线水平,然后2组小鼠均接受MPTP腹腔注射7天诱导亚急性帕金森病模型（同第一部分实验保持一致）,之后进行运动相关行为学（爬杆、悬挂、转棒）、情绪（旷场实验）及认知相关行为学（Y型迷宫自发交替实验、新物体识别实验）测试分析。2.对上述假手术+MPTP组和腹腔交感神经节损毁手术+MPTP组小鼠中脑黑质区域进行多巴胺能神经元（TH）和小胶质细胞（IBA-1）免疫荧光染色,统计2组小鼠黑质致密区域多巴胺能神经元数量以及小胶质细胞数量。3.为了排除MPTP腹腔注射对于腹腔交感神经节所造成的影响对最终实验结果可靠性的干扰,我们使用6-OHDA这种不透过血脑屏障的药物进行颅内单侧纹状体注射诱导帕金森病模型,再次通过行为学、免疫荧光染色的方式分别探究3 m A电针合谷穴和腹腔交感神经节损毁在帕金森病模型小鼠中的治疗作用。将小鼠分为4组:对照组、模型组、电针3 m A组和腹腔神经节损毁组。对所有小鼠进行为期3天的爬杆、悬挂和转棒行为学训练,然后对所有实验小鼠进行腹腔手术,除腹腔神经节损毁组小鼠进行神经节损毁手术外,其余3组小鼠均进行腹腔神经节假手术。手术恢复2周后,进行运动行为学基线测定,然后使用6-OHDA立体定位注射诱导帕金森病模型,造模结束后对电针3 m A组小鼠进行连续5天的合谷穴电针干预,干预结束后4组小鼠进行爬杆、悬挂和转棒行为学测试分析。4.对上述对照组、模型组、电针3 m A组和神经节损毁组4组小鼠中脑黑质区域进行多巴胺能神经元（TH）和小胶质细胞（IBA-1）免疫荧光染色,统计比较各组小鼠黑质致密区域多巴胺能神经元数量以及小胶质细胞数量。结果第一部分1.3 m A电针刺激合谷穴显著改善MPTP亚急性帕金森病模型小鼠的运动障碍。（1）MPTP亚急性帕金森病模型诱导成功,和对照组相比,MPTP模型组小鼠在三种行为学中均表现出明显的运动障碍:其中爬杆行为学（*P＜0.05）,悬挂行为学(***P＜0.001),转棒行为学(**P＜0.01),差异均有统计学意义。（2）与MPTP模型组相比,3 m A电针刺激合谷穴能显著提升帕金森病模型小鼠的运动协调能力:其中爬杆行为学(**P＜0.01),悬挂行为学(****P＜0.0001),转棒行为学(**P＜0.01);而假针组和1 m A电针组与MPTP模型组小鼠对比,三种行为学差异均没有统计学意义（P＞0.05）。2.3 m A电针刺激合谷穴改善MPTP亚急性帕金森病模型小鼠的认知障碍。（1）旷场实验中,以小鼠进入中心区域次数为评判标准。与对照组相比,MPTP模型组小鼠并未出现焦虑样行为表现（P=0.85）,MPTP模型组与MPTP+电针3 m A组小鼠之间的差异也无统计学意义（P=0.62）。（2）Y型迷宫自主交替实验中,和对照组相比,MPTP模型组小鼠出现明显的空间记忆障碍（*P＜0.05）,而3 m A电针刺激合谷穴能明显改善这种空间记忆障碍（n=18,*P＜0.05）,差异具有统计学意义。（3）新物体识别实验中,与对照组相比,模型组小鼠并未出现学习记忆障碍（P=0.89）,3m A电针组与模型组之间的差异也并无统计学意义,说明本实验中,MPTP诱导的帕金森病模型小鼠并未出现学习记忆障碍。3.3 m A电针刺激合谷穴减少MPTP亚急性帕金森病模型小鼠中脑黑质多巴胺能神经元的丢失和小胶质细胞的增殖。（1）和对照组相比,MPTP模型组小鼠黑质内小胶质细胞数量明显增多(n=7,****P＜0.0001);和MPTP模型组对比,MPTP+电针3 m A组小鼠黑质内小胶质细胞数量明显减少(n=7,****P＜0.0001)。（2）对比对照组,MPTP模型组小鼠双侧中脑黑质致密区域多巴胺能神经元的数量明显减少(****P＜0.0001);对比MPTP模型组,MPTP+电针3 m A组小鼠黑质内多巴胺能神经元的数量明显增多（*P＜0.05）。第一部分结果说明3 m A电针刺激合谷穴能明显改善帕金森病模型小鼠的运动障碍,而1 m A电针刺激并不能改善帕金森病模型小鼠运动障碍。并且,3 m A电针刺激合谷穴对于MPTP亚急性帕金森病模型小鼠运动障碍及空间认知障碍的改善是通过抑制黑质致密区域小胶质细胞的增殖,从而抑制由小胶质细胞持续激活所诱导的中枢神经系统炎症级联反应,最终减少由持续性炎症反应引起的多巴胺能神经元的损耗所实现的。第二部分1.伪狂犬病毒示踪神经元4日后主要表达在小鼠双侧网状核和蓝斑区域。2.3 m A电针刺激合谷穴能明显激活蓝斑区域c-fos表达(电针组n=3,对照组n=3,****P＜0.0001),而这种表达能被腹腔交感神经节损毁术所逆转(神经节损毁组n=3,***P＜0.001)。3.3 m A电针刺激合谷穴和腹腔交感神经节损毁术均能增加MPTP亚急性帕金森病模型小鼠肠道内乳酸杆菌丰度。与MPTP模型组相比,MPTP+电针3 m A组小鼠肠道内乳酸杆菌的丰度明显增加(****P＜0.0001);与MPTP模型组相比,神经节损毁术组小鼠肠道内乳酸杆菌的丰度明显增加（*P＜0.05）。第二部分结果说明3 m A电针刺激合谷穴有可能通过抑制腹腔交感神经活性对肠道功能进行调节,改变肠道菌群的组成,并增加肠道内乳酸杆菌的含量,而这种微生物组成的改变能通过改善肠道屏障的通透性,从而参与调节小胶质细胞的活性,抑制中枢神经系统炎症反应,减少由持续性炎症反应所诱导的多巴胺能神经元的死亡,最终干预帕金森病发生发展。第三部分1.（1）腹腔交感神经节损毁手术并不影响小鼠自身运动能力。与假手术组对比,神经节损毁组小鼠在爬杆测试（P=0.3109）,悬挂测试（P=0.1258）和转棒测试（P=0.8990）中的差异均无统计学意义;（2）腹腔交感神经节损毁术能在一定程度上抑制MPTP对于小鼠运动能力的损害。在MPTP腹腔注射诱导亚急性帕金森病模型成功后,与假手术组对比,神经节损毁组在爬杆测试（P=0.9914）中的差异无统计学意义;悬挂测试（*P＜0.05）和转棒测试(**P＜0.01)中的差异均有统计学意义;2组小鼠在旷场、Y型迷宫自主交替行为学和新物体识别实验中的差异均无统计学意义（P＞0.4782）。2.腹腔交感神经节损毁术在一定程度上减少MPTP诱导的小鼠中脑黑质多巴胺能神经元的丢失和小胶质细胞的增殖。和假手术组相比,神经节损毁小鼠双侧中脑黑质致密区域小胶质细胞的数量呈减少趋势（P=0.08）,而多巴胺能神经元的数量呈现出增加的趋势（P=0.13）。3.（1）腹腔交感神经节损毁术不影响小鼠自身运动能力。和其他三组腹腔假手术小鼠（每组n=10）对比,腹腔交感神经节损毁术组（n=10）小鼠在爬杆测试（P＞0.05）、悬挂测试（P＞0.05）和转棒测试（P＞0.05）中的差异均无统计学意义。（2）3 m A电针刺激合谷穴能显著改善6-OHDA单侧纹状体注射诱导的帕金森病模型小鼠的运动障碍。与模型组对比,电针3 m A组小鼠在爬杆测试（*P＜0.05）,悬挂测试（*P＜0.05）和转棒测试（*P＜0.05）中的差异均有统计学意义。（3）腹腔交感神经节损毁能在一定程度上改善6-OHDA单侧纹状体注射诱导的帕金森病模型小鼠的运动障碍。对比模型组,神经节损毁组小鼠在爬杆测试(**P＜0.01)和悬挂测试（*P＜0.05）中的差异均有统计学意义;而转棒测试（P＞0.05）中的差异无统计学意义。4.（1）3 m A电针刺激合谷穴显著减少6-OHDA诱导的中脑黑质致密区域多巴胺能神经元的丢失和小胶质细胞的增殖。与模型组对比,电针3 m A组小鼠中脑黑质致密区域TH阳性细胞数量明显增多（*P＜0.05）,小胶质细胞数量明显减少(****P＜0.0001)。（2）腹腔交感神经节损毁术能显著减少6-OHDA诱导的中脑黑质致密区域多巴胺能神经元的丢失和小胶质细胞的增殖。和模型组对比,腹腔神经节损毁组小鼠中脑TH阳性细胞数量明显增加（*P＜0.05）,小胶质细胞数量明显减少(**P＜0.01)。第三部分通过MPTP和6-OHDA两种不同的帕金森病模型构建,对比三种不同运动行为学测定结果,再次验证了3 m A电针刺激合谷穴的有效性;并进一步通过中脑黑质致密区域小胶质细胞和多巴胺能神经元的免疫荧光染色结果,证明了抑制腹腔交感神经节活性改善帕金森病运动障碍是通过抑制小胶质细胞参与的中枢系统炎症级联反应,从而减少多巴胺能神经元死亡的过程所实现的。结论综合以上结果,我们得出以下结论:（1）合谷穴单一穴位刺激能有效治疗帕金森病。（2）3 m A电针刺激合谷穴,而不是1 m A,能显著改善帕金森病模型小鼠的运动障碍。（3）3 m A电针刺激合谷穴通过对腹腔交感神经元活性的抑制调节肠道菌群的组成和丰度,增加乳酸杆菌的含量,调节小胶质细胞参与的中枢系统炎症反应,从而减少多巴胺能神经元的丢失。本课题进一步揭示了电针刺激合谷穴可能通过微生物-肠-脑轴的神经调控机制介导对PD的潜在治疗作用。