研究背景与目的:脓毒症(sepsis)是由各种致病菌,尤其是革兰阴性菌进入血液生长繁殖引起的全身性系统性过度炎症反应,其常伴发血压骤降,寒战高热及呼吸循环衰竭等严重并发症。由于其发病原因的多样性,病情进展的复杂性以及致病因素的不确定性,现已成为重症医学科死亡率最高的病种之一。以往认为,脓毒症发生发展初期过度活化的单核-巨噬细胞系统所介导的“细胞因子风暴”是造成机体过度炎症反应,并导致脏器损害的重要因素之一。虽然目前已有较多针对脓毒症中如何调控炎症因子释放的研究,但脓毒症的罹患率及病死率仍居高不下,因此我们迫切需要寻找新的作用靶点或治疗策略以抑制巨噬细胞(macrophages,Mj)介导的过度炎症反应,以为今后预防及治疗脓毒症提供新的思路和理论基础。细胞色素P450 1A1(cytochrome P450 1A1,CYP1A1)是一种主要存在于肝脏及肠道当中的单加氧酶,并具有环氧化酶及羟化酶双重作用。过去对CYP1A1的研究多关注于其对外源性有害物质的代谢调控,例如CYP1A1可代谢二恶英,黄曲霉素等外源性毒素为细胞毒性产物,引发DNA损伤从而导致癌症发生。近年来,越来越多的研究开始将CYP1A1与免疫调控联系起来。有研究表明,CYP1A1敲除可加剧高浓度氧中毒导致的小鼠急性肺损伤,具体表现为肺水肿加重,蛋白渗出及中性粒细胞浸润加剧等病理改变。另有研究报道,整体性过表达CYP1A1可增加小鼠肠道感染柠檬酸杆菌时的死亡率,提示CYP1A1对机体应对应激反应具有重要的调控作用。除了对机体整体的调控作用外,CYP1A1还可影响不同细胞中炎症因子的表达。CYP1A1过表达能显著降低脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激时,牛乳腺上皮细胞所分泌的促炎因子,但具体机制不明。有研究报道,多氯联苯118可通过激活芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,Ah R)上调CYP1A1,从而活化大鼠甲状腺FRLT-5细胞中的丝裂原活化蛋白激酶通路以释放大量的促炎因子,如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-6(Interleukin-6,IL-6)等。在脓毒症或炎症的发生发展过程中,巨噬细胞往往在1型(M1)或2型(M2)型之间相互转化。在反应初期巨噬细胞往往以M1型为主,主要起促炎杀菌的作用,而在炎症反应中后期,白介素-4(Interleukin-4,IL-4)分泌开始大量增加以促进M1型细胞向M2型极化,从而起到抗炎修复的作用。有研究报道,在白介素-13诱导的M2中,活化的信号传导及转录激活蛋白6(signal transducer and activator of transcription 6,STAT6)可引起CYP1A1表达显著增加,使其羟化酶相关代谢产物生成增多而促进巨噬细胞表达2型极化指标。但CYP1A1是否能直接调控巨噬细胞向2型极化,能否直接调控2型极化指标上游转录因子仍然未知。巨噬细胞作为固有免疫应答的第一道防线,其极化与吞噬功能对机体应对脓毒症发生发展具有十分重要的意义。虽然上述研究初步揭示了CYP1A1与免疫调控的关系,但其对极化因素刺激时,尤其是对脓毒症中巨噬细胞极化与吞噬的调控作用仍然不明。本研究将以野生型小鼠腹腔巨噬细胞为研究起点,结合Ah R敲除小鼠腹腔巨噬细胞、野生型小鼠外周血单核细胞(mouse peripheral blood monocytes,m PBMCs)及人外周血单核细胞(human peripheral blood monocytes,h PBMCs),建构CYP1A1沉默和过表达的原代巨噬细胞,以及CYP1A1基因过表达的RAW264.7稳转细胞系进行机制研究。使用LPS、大肠杆菌(Escherichia.Coli,E.coli)或盲肠结扎穿刺术(cecal ligation and puncture,CLP)建立体内体外脓毒症模型以诱导巨噬细胞向M1型极化,并使用IL-4诱导巨噬细胞向M2型分化。在确定相关机制的基础上,分别引入相关通路或靶点的抑制剂进行体外验证研究,同时进行在体基因编辑细胞回输实验以及引入CYP1A1敲除小鼠进行相关理论的体内验证研究。通过以上方法与实验,我们将明确过度活化巨噬细胞中CYP1A1的变化规律,研究CYP1A1对巨噬细胞极化及吞噬功能的调控作用,并阐明其中的作用机制,实现将CYP1A1作为调控靶点以逆转脓毒症的发生发展。实验方法:一、CYP1A1对巨噬细胞极化功能的影响。1.给予小鼠腹腔注射LPS或E.coli建立脓毒症模型,提取造模后的小鼠腹腔巨噬细胞,使用蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测其中CYP1A1蛋白表达水平;2.提取小鼠腹腔巨噬细胞,在体外培养纯化后给予LPS刺激建立1型极化炎症模型或给予IL-4刺激建立2型极化模型,使用WB及q RT-PCR分别检测其中CYP1A1蛋白及基因表达水平;3.构建CYP1A1过表达的RAW264.7细胞系(CYP1A1/RAW)以及表达阴性对照载体的RAW264.7细胞系(NC/RAW),使用LPS或IL-4刺激CYP1A1/RAW及NC/RAW,收集细胞团块及细胞培养上清,使用ELISA及q RT-PCR检测其中1型极化指标TNF-α及IL-6蛋白和基因表达水平,使用WB及q RT-PCR检测其中2型极化指标-精氨酸酶-1(Arginase-1,Arg-1)蛋白和基因表达水平;4.提取AhR敲除小鼠及野生型小鼠腹腔巨噬细胞,在体外培养纯化后沉默其中CYP1A1蛋白表达,再给予LPS刺激。收集细胞培养上清用ELISA检测其中TNF-α及IL-6蛋白表达水平;5.给予RAW264.7细胞CYP1A1特异性抑制剂(玫瑰树碱和丹叶大黄素)预作用,完毕后再给予LPS刺激,并收集细胞培养上清用ELISA检测其中TNF-α及IL-6蛋白表达水平。二、CYP1A1调控巨噬细胞极化的具体机制。1.使用LPS刺激CYP1A1/RAW及NC/RAW,收集细胞团块用WB检测丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)及c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)/激活子蛋白-1(activator protein-1,AP-1)等信号通路变化情况,使用IL-4刺激后检测Janus激酶1(janus kinase 1,JAK1)/STAT6通路变化;2.分别敲除CYP1A1/RAW及NC/RAW细胞中的JNK、AP-1、JAK1及STAT6,使用LPS或IL-4刺激后收集细胞团块,用ELISA检测细胞培养上清中TNF-α及IL-6蛋白水平变化,用WB检测Arg-1、JNK/AP-1及JAK1/STAT6变化情况,并用凝胶电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测上述细胞胞核蛋白与DNA结合活性变化;3.使用LPS或IL-4刺激CYP1A1/RAW及NC/RAW,收集细胞上清用ELISA法检测其中12(S)-氢氧化二十碳四烯酸(12(S)-HYDROXY-5(Z),8(Z),10(E),14(Z)-EICOSATETRAENOICACID,12(S)-HETE)及15(S)-氢氧化二十碳四烯酸(15(S)-HYDROXY-5(Z),8(Z),11(Z),13(E)-EICOSATETRAENOICACID,15(S)-HETE)含量变化,检测细胞中CYP1A1羟基化酶活性;4.联合使用12(S)-HETE与LPS或15(S)-HETE与IL-4刺激RAW264.7细胞,收集细胞团块及细胞培养上清,使用ELISA及q RT-PCR检测其中TNF-α及IL-6蛋白和基因表达水平,用WB检测Arg-1、JNK/AP-1及JAK1/STAT6变化;5.使用LPS刺激CYP1A1/RAW及NC/RAW,同时使用12(S)-HETE中和抗体中和CYP1A1过表达后所产生的12(S)-HETE,使用ELISA检测细胞上清中TNF-α及IL-6蛋白表达水平,用WB检测JNK/AP-1信号通路变化,并用EMSA检测上述细胞胞核蛋白与DNA结合活性变化;6.用LPS或IL-4刺激CYP1A1/RAW及NC/RAW,收集细胞团块检测其中12-脂氧合酶(12-lipoxynase,12-LOX)或15-脂氧合酶(15-lipoxynase,15-LOX)基因变化,并使用12-LOX抑制剂ML355或15-LOX抑制剂PD146176作用CYP1A1/RAW及NC/RAW,收集细胞团块及上清分别检测CYP1A1羟基化酶活性、Arg-1、TNF-α及IL-6蛋白表达水平;7.突变CYP1A1/RAW细胞中羟基化酶活性作用位点,使用LPS或IL-4刺激后采用ELISA检测细胞上清中TNF-α及IL-6蛋白表达水平、12(S)-HETE及15(S)-HETE变化情况,用WB检测Arg-1、JNK/AP-1及JAK1/STAT6变化,并用EMSA检测上述细胞胞核蛋白与DNA结合活性变化。三、CYP1A1对巨噬细胞吞噬功能的影响及其在体内的调控作用。1.在小鼠腹腔巨噬细胞中沉默或过表达CYP1A1,或给予12(S)-HETE及丹叶大黄素预作用后使用E.coli进行刺激,收集细胞团块进行菌落计数以反应吞噬能力变化,同时用q RT-PCR及WB检测吞噬受体A类清道夫受体(scavenger receptor-A,SR-A)的变化,最后使用SR-A中和抗体拮抗SR-A,并再次测定E.coli刺激巨噬细胞后的菌落计数;2.向小鼠腹腔注射E.coli建立脓毒症模型,分离其腹腔巨噬细胞及PBMCs,用q RT-PCR检测PBMCs中CYP1A1基因表达,用激光共聚焦检测PBMCs中JNK/AP-1活化情况,使用WB检测腹腔巨噬细胞中JNK/AP-1信号通路变化;3.预先向小鼠腹腔中注射CYP1A1过表达及CYP1A1羟化酶活性突变的腹腔巨噬细胞及表达空载体的阴性对照腹腔巨噬细胞,再给予小鼠E.coli或CLP进行脓毒症造模,观察移植CYP1A1过表达及酶活性突变细胞对脓毒症小鼠生存率的影响;4.给予E.coli或CLP诱导的脓毒症小鼠丹叶大黄素作用,并观察丹叶大黄素治疗对小鼠生存率的影响;5.向小鼠腹腔注射LPS建立脓毒症休克模型,动态检测PLF中IL-4变化水平,在IL-4表达高峰期向小鼠腹腔注射CYP1A1过表达的腹腔巨噬细胞,观察CYP1A1过表达细胞移植对脓毒症休克小鼠PLF中TNF-α表达的影响;6.采集大坪医院重症医学科30名脓毒症患者及30名健康志愿者外周血,分离血浆和PBMCs,分别用ELISA检测血浆中12(S)-HETE水平,用q RT-PCR检测PBMCs中CYP1A1基因水平。根据临床诊断标准计算每名患者的序贯器官衰竭评估值(Sequential Organ Failure Assessment,SOFA),并与12(S)-HETE及CYP1A1水平进行关联分析;7.给予CYP1A1敲除小鼠及野生型小鼠腹腔注射LPS造模,取其腹腔灌洗液用ELISA检测其中TNF-α及IL-6蛋白表达水平,取其腹腔巨噬细胞用PCR检测其中TNF-α及IL-6基因表达水平,取其肺脏用于大体观察及苏木精-伊红染色法检测。实验结果:一、CYP1A1对巨噬细胞极化功能的影响。1.给予小鼠腹腔注射LPS或E.coli打击后,其腹腔巨噬细胞中的CYP1A1表达水平随时间增加而逐步增高;2.体外培养小鼠腹腔巨噬细胞时,给予LPS或IL-4刺激后其CYP1A1蛋白及基因表达水平同样也随时间增加而逐步增高;3.CYP1A1过表达使LPS刺激时RAW264.7细胞合成分泌的TNF-α及IL-6水平显著增加,而使IL-4刺激时RAW264.7细胞合成的Arg-1表达增加;4.敲除Ah R并不影响CYP1A1沉默所致的TNF-α及IL-6水平降低;5.玫瑰树碱和丹叶大黄素均可显著降低炎性巨噬细胞分泌的TNF-α及IL-6水平。二、CYP1A1调控巨噬细胞极化的具体机制。1.CYP1A1过表达使LPS刺激时,RAW264.7细胞中JNK/AP-1通路活化水平显著增高,而使IL-4刺激时RAW264.7细胞中JAK1/STAT6磷酸化水平明显升高;2.在CYP1A1过表达RAW264.7细胞中敲除JNK/AP-1通路可显著降低由CYP1A1过表达引起的TNF-α及IL-6表达增高,而敲除JAK1/STAT6通路可明显减少由CYP1A1过表达引起的Arg-1表达增加;3.使用LPS刺激时,CYP1A1过表达可增加CYP1A1羟化酶活性及其产物12(S)-HETE的产量,而使用IL-4刺激时,CYP1A1过表达可增加CYP1A1羟化酶活性及其另一羟化产物15(S)-HETE的产量;4.与单用LPS相比,12(S)-HETE与LPS联合刺激可显著增加RAW264.7细胞分泌的TNF-α及IL-6水平及JNK/AP-1通路活化水平,而与单用IL-4相比,15(S)-HETE与IL-4联合刺激可增加RAW264.7细胞合成的Arg-1水平及JAK1/STAT6通路活化水平;5.使用LPS刺激CYP1A1/RAW及NC/RAW,同时使用12(S)-HETE中和抗体中和CYP1A1过表达后所产生的12(S)-HETE,可显著降低CYP1A1过表达所致的TNF-α及IL-6表达水平增高,减弱JNK/AP-1活化水平,并弱化胞核中AP-1与DNA结合活性;6.CYP1A1过表达并不影响12-LOX及15-LOX的表达水平,分别使用这两者的抑制剂也不能逆转CYP1A1过表达导致的促炎反应;7.突变CYP1A1/RAW细胞中羟基化酶活性作用位点,可明显降低CYP1A1过表达所致的12(S)-HETE、15(S)-HETE、TNF-α及IL-6表达水平增高,降低Arg-1表达水平,并减弱JNK/AP-1及JAK1/STAT6通路活性。三、CYP1A1对巨噬细胞吞噬功能的影响及其在体内的调控作用。1.CYP1A1过表达可显著降低巨噬细胞对E.coli的吞噬能力,并且此效应是通过调控吞噬受体SR-A实现的。沉默CYP1A1及给予丹叶大黄素刺激可增强巨噬细胞的吞噬能力,而12(S)-HETE对吞噬无明显影响;2.接受E.coli打击后,小鼠PBMCs中CYP1A1表达水平及JNK/AP-1活化水平显著增高,而腹腔巨噬细胞中JNK/AP-1通路明显活化;3.在腹腔内移植了CYP1A1过表达的巨噬细胞后,面对脓毒症打击时小鼠死亡率显著增加。移植CYP1A1羟化酶活性突变的腹腔巨噬细胞对死亡率无明显影响;4.腹腔注射丹叶大黄素可降低CLP或E.coli诱导的小鼠脓毒症死亡率;5.给予小鼠腹腔注射LPS后,在其PLF内IL-4达到最高峰时向小鼠腹腔内移植CYP1A1过表达的巨噬细胞,可使其PLF中TNF-α表达水平显著下降;6.与健康志愿者相比,脓毒症患者外周血浆中12(S)-HETE水平显著增加,而PBMCs中CYP1A1基因水平也明显升高,并且与脓毒症严重程度(SOFA评分)呈正相关变化。7.CYP1A1敲除可导致LPS刺激下小鼠腹腔灌洗液及巨噬细胞中TNF-α、IL-6表达降低,但可加重肺部损伤。结论:一、LPS及IL-4刺激均可显著增加小鼠巨噬细胞中CYP1A1表达水平,且LPS刺激的CYP1A1升高为非Ah R依赖性;二、在LPS所致的巨噬细胞1型极化过程中,CYP1A1可通过其羟基化酶作用生成代谢产物12(S)-HETE,强化JNK/AP-1通路活化水平,从而导致促炎因子TNF-α及IL-6合成分泌增加(与12-LOX无关),而在IL-4所致的2型极化过程中,CYP1A1可通过其羟基化酶作用生成代谢产物15(S)-HETE,强化JAK1/STAT6通路活化水平,从而导致2型极化指标Arg-1合成增加(与15-LOX无关);三、在脓毒症炎症反应初期(巨噬细胞1型极化期),CYP1A1可增加巨噬细胞所分泌的促炎因子并导致脓毒症小鼠死亡率增加,而CYP1A1抑制剂丹叶大黄素可有效降低脓毒症小鼠死亡率,但在炎症反应后期(巨噬细胞2型极化期)IL-4表达增加,CYP1A1可增加巨噬细胞所合成的Arg-1,使巨噬细胞向抗炎型(2型)极化并促进小鼠腹膜炎消退。此外,CYP1A1还可通过调控SR-A受体以影响巨噬细胞的吞噬作用;四、在脓毒症患者体内同样存在CYP1A1-12(S)-HETE-JNK/AP-1信号轴,并且CYP1A1及12(S)-HETE表达水平与脓毒症患者病情严重程度呈正相关变化;五、CYP1A1敲除可减弱小鼠腹膜炎的同时加重肺损伤,说明CYP1A1的调控作用具有空间分布异质性。