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中国是花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim)的起源中心,花椒在我国栽培历史悠久,品种资源繁多,上个世纪80年代以来栽培面积逐年上升,随着农业产业结构的调整,花椒的栽培面积在近几年增长明显加快,这对于解决“三农”问题和边远地区农民脱贫具有十分重要的意义,但是由于在引种栽培的过程中,同种异名、同名异种的现象比较严重,这为花椒种质资源的筛选、引种、鉴定等工作带来一定的困难,同时,最新的研究表明花椒是单性结实,因此它又具有较高的遗传稳定性,这为花椒的选择育种奠定了物质和理论基础。据不完全统计我国有花椒近60个品种,全世界约有200品种,这些都给花椒类种质资源的筛选、鉴定和利用带来了困难。本文研究以川、渝地区18个花椒品种为研究对象,旨在探讨适合于花椒品种鉴定的RAPD技术体系,并对这18花椒品种的亲缘关系进行分析,构建基于分子性状的聚类分析树状图,为花椒类植物遗传多样性的研究提供分子水平上的证据;同时,为花椒植物种质资源的保护、品种鉴定和开发利用提供理论依据。
研究结果如下:1.建立并优化了花椒DNA提取及RAPD扩增反应体系(1)简化后的CTAB法提取的DNA是适用于花椒RAPD扩增的快速、高效的方法。春季刚刚展开的嫩叶片为DNA提取的最佳材料,但是由于花椒含有杂质较多,易导致扩增失败。花椒叶片DNA提取过程中极易被氧化,因此需要及时补加PVP与B一疏基乙醇,并适当提高用量,以防止氧化变褐。
(2)扩增程序为95℃变性3min,94℃变性2min,1个循环;94℃变性50s,38℃复性1min,72℃延伸1min20s,设42个循环,最后72℃保温5min时,25uL反应体系中包括:2.0uL(2.5mmol/L)dNTP,2.0uL(10mmol/L)Mg2+,4uL(40ng)引物,模板DNA2.0uL,Taq酶(Sangon)1.5U,3uL10Xbuffer缓冲液,其余部分用无菌双蒸水补充。
2.从S系列50个引物中筛选出能稳定扩增的21个引物,用这些引物对18个花椒品种进行扩增,共扩增出173条DNA条带,其中多态性条带132条,占76.3%,得到了21张各自不同的RAPD指纹图谱。
3.不同的RAPD扩增仪对花椒品种的扩增效果影响有差异但不显著,而反应时间上的差别较大。