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目的：基于代谢组学及系统药理学研究孔圣枕中丹（SCPE）对轻度认知障碍小鼠的干预效果，阐明孔圣枕中丹对轻度认知障碍小鼠的药理作用机制，分析不同剂量的孔圣枕中丹对轻度认知障碍小鼠脑组织代谢轮廓及生物代谢标志物的影响并对孔圣枕中丹改善轻度认知障碍的作用机制进行生物信息挖掘，为孔圣枕中丹干预轻度认知障碍的基础及临床研究提供依据。
方法：以7月龄雄性SAMP8小鼠为研究对象，以7月龄雄性SAMR1小鼠为对照组，以孔圣枕中丹低（2.3mg/kg）中(4.6mg/kg)高(9.2mg/kg)剂量为给药组。利用水迷宫、神经病理染色、ELISA、TUNEL、WB等技术对孔圣枕中丹干预轻度认知障碍模型小鼠进行药理作用评价，从慢性炎症诱发的神经细胞焦亡的角度研究孔圣枕中丹改善认知功能的药理作用机制。基于UHPLC/Q-TOF-MS平台对孔圣枕中丹干预轻度认知障碍小鼠的作用进行代谢组学评价，筛选并鉴定轻度认知障碍的脑组织生物代谢标志物及通路；阐明不同剂量的孔圣枕中丹回调生物代谢标志物及通路的变化机制。利用系统药理学方法，根据ADMET模型筛选孔圣枕中丹发挥改善认知功能作用的主要成分，挖掘更多可能的作用机制。
结果：
1.水迷宫结果：给药前（0d）与空白组比较，模型组逃避潜伏期明显延长，但穿越平台次数无统计学差异（P＞0.05）。给药7d后，与空白组比较，模型组及低、中、高剂量组（LD/MD/HD）小鼠的学习记忆能力明显减退（P＜0.01）但SCPE对学习记忆能力的改善程度不明显。给药14d后，SCPE表现出明显改善学习记忆的功能（P＜0.01）。给药21d、28d后SCPE可以改善小鼠的学习记忆能力，并与给药剂量呈正相关（P＜0.01）。神经病理结果：与空白组比较，模型组海马CA1~CA3区的神经元数量显著减少，并呈现出变性、坏死、淀粉样物质大量沉积、尼式体数量减少及脱颗粒化等异常病理改变。不同剂量的SCPE干预后，上述病理改变得到改善，其中以高剂量组表现明显。TUNEL染色结果：与空白组相比，模型组海马CA1~CA3区TUNEL阳性细胞数及比值显著增加（**P＜0.01）；与模型组比较，SCPE低、中、高剂量组海马CA1~CA3区TUNEL阳性细胞数量显著减少（＃＃P＜0.01），比值明显降低（＃＃P＜0.01），在一定程度上具有剂量依赖性。ELISA结果：与空白组相比，模型组小鼠血清中炎症介质IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，SCPE不同剂量给药28d后均能不同程度的降低小鼠血清中炎症介质IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平，且高剂量组（HD）相对表现最为明显。其中IL-6、IL-18水平的变化与SCPE的给药剂量呈较强的相关性。WB结果：与空白组相比，模型组海马中的NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、Aβ的蛋白表达水平显著增高（P＜0.01）。在连续灌胃SCPE28d后，各剂量组的海马组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、Aβ蛋白表达均表现为不同程度的下调，且高剂量组更为明显。
2.经代谢组学分析后，我们共发现84个MCI的生物代谢标志物，包括血管紧张素、白三烯D4、十六烷二酸、(3z,6z)3,6-壬二烯醛、异丙肾上腺素、D-鸟氨酸、甲氧胺、瓜氨酸、松柏醛、异丙基苹果酸、L-鼠李树胶糖、N-乙酰基-L-组氨酸、洋姜荽苷、精氨酸、鸟氨酸、2-异丙基苹果酸、L-亮氨酸、γ-谷酰基-硒甲基硒代半胱氨酸、木二糖、L-正亮氨酸等。对代谢物分析后获得与MCI相关的主要代谢通路8条，分别为：D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢通路；丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢通路；苯丙氨酸代谢通路；精氨酸和脯氨酸代谢通路；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成；半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路；氨酰tRNA生物合成；D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢通路。其中低剂量的SCPE可以回调40个代谢标志物，包括：十六烷基二酸、二十碳二烯酸、异亮氨酸、白三烯D、顺式-11-二十碳烯酸、苯丙氨酸、异丙基苹果酸、反式肉桂酸、N1-盐酸乙酰精胺、苯丙氨酸、赤霉素A15开放内酯等。对代谢物分析后获得4条代谢通路：苯丙氨酸代谢通路；丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢通路；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成；D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢通路。中剂量的SCPE可以回调48个生物代谢标志物包括：十六烷基二酸、二十碳二烯酸、异亮氨酸、白三烯D、顺式-11-二十碳烯酸、反式肉桂酸、N1-盐酸乙酰精胺、苯丙氨酸、赤霉素A15开放内酯、左旋肉碱、4-羟基异环磷酰胺、血管紧张素、16-羟基十六烷酸、蓖麻油酸、5-羟丁二乙酸、甲地嗪、L-亮氨酸。对代谢物分析后获得4条主要的代谢通路：苯丙氨酸代谢通路；丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢通路；半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路；D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢通路。高剂量的SCPE可以回调54个生物代谢标志物包括：十六烷基二酸、异亮氨酸、白三烯D、顺式-11-二十碳烯酸、异丙基苹果酸、反式肉桂酸、N1-盐酸乙酰精胺、苯丙氨酸、赤霉素A15开放内酯、左旋肉碱、4-羟基异环磷酰胺、甲地嗪、哌啶、1-苯基-1,2-丙二酮、邻甲酚、LysoSM(d18:1)、顺-3,顺-6-壬二烯醛、α-生育三烯酚、甘露醇-1-磷酸盐、β-酪氨酸、正亮氨酸、2-异丙基苹果酸、羟甲基戊二酸。对代谢物分析后获得4条主要的代谢通路为：苯丙氨酸代谢通路；丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢通路；半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路；D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢通路。
3.运用系统药理学手段，按ADMET（吸收/分布/代谢/排泄/毒性）的模型筛选出孔圣枕中丹中28个符合OB≥30%、DL≥0.1、BBB≥-0.3的活性成分，预测相应的靶点有84个；收集到与MCI存在直接、间接联系的靶蛋白并与孔圣枕中丹潜在靶点取交集共获得72个靶蛋白库。使用Cytoscape3.7.1软件构建“药物-成分-靶点-疾病”的MCTD网络，分析孔圣枕中丹的配伍机制为：君药为石菖蒲；臣药为远志；佐药为龟甲；使药为龙骨。活性最强的三种活性化合物分别是来自石菖蒲的2-O-甲基异甘草甙元和别香橙烯以及来自远志的1,6－二羟基－3,7－二甲氧基呫吨酮，最关键的三个靶点分别为PTGS2、GABRA1、CHRM1。将SCPE干预MCI的72个靶蛋白导入STRING数据库构建蛋白互作网络，并运用Cytoscape3.7.1软件进行可视化处理及拓扑分析，筛选出度及介数均大于各自平均数的重要靶点15个，由PPI网络图可直观发现排在前三位的靶点分别为TP53、NOS3、CASP3。采用DAVID、Metascape、JTreView平台分别对PPI网络中筛选出的15个关键靶点做Heatmap、GO、Kegg分析发现SCPE干预MCI参与的主要GO条目有调节血液循环、突触膜的组成及突触传递、有机羟基化合物的转运、多细胞生物的体内平衡、对有毒物质的反应等过程；Kegg条目有受体配体作用的神经活性、cGMP-PKG信号通路、cAMP信号通路、前列腺癌、吗啡成瘾、甲状腺激素信号通路、p53信号通路、IL-17信号通路等。
结论：
1.孔圣枕中丹可以通过抑制Aβ蛋白沉积及调节经典的细胞焦亡NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路发挥改善轻度认知障碍的药理作用。孔圣枕中丹改善认知功能具有较为明显的量效关系，以高剂量的作用效果最为明显。
2.轻度认知障碍的发病机理可能是由于脑组织中血管紧张素、白三烯D4、十六烷二酸等代谢标志物含量的变化，影响D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢；丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢；苯丙氨酸代谢；精氨酸和脯氨酸代谢；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成；半胱氨酸和蛋氨酸代谢；氨酰tRNA生物合成；D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢异常所致。
3.孔圣枕中丹改善轻度认知障碍的作用机理主要是通过回调十六烷基二酸、二十碳二烯酸、异亮氨酸等代谢标志物的水平，调控苯丙氨酸代谢、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢通路。
4.孔圣枕中丹可以通过2-O-甲基异甘草甙元、别香橙烯以及1,6－二羟基－3,7－二甲氧基呫吨酮等活性成分作用于关键靶点PTGS2、GABRA1、CHRM1、TP53、NOS3、Caspase-3调控受体配体作用的神经活性及cGMP-PKG等信号通路发挥改善认知功能的作用，表明孔圣枕中丹治疗轻度认知障碍的“多组分-多靶点-多通路”协同关联的作用机制。
方法：以7月龄雄性SAMP8小鼠为研究对象，以7月龄雄性SAMR1小鼠为对照组，以孔圣枕中丹低（2.3mg/kg）中(4.6mg/kg)高(9.2mg/kg)剂量为给药组。利用水迷宫、神经病理染色、ELISA、TUNEL、WB等技术对孔圣枕中丹干预轻度认知障碍模型小鼠进行药理作用评价，从慢性炎症诱发的神经细胞焦亡的角度研究孔圣枕中丹改善认知功能的药理作用机制。基于UHPLC/Q-TOF-MS平台对孔圣枕中丹干预轻度认知障碍小鼠的作用进行代谢组学评价，筛选并鉴定轻度认知障碍的脑组织生物代谢标志物及通路；阐明不同剂量的孔圣枕中丹回调生物代谢标志物及通路的变化机制。利用系统药理学方法，根据ADMET模型筛选孔圣枕中丹发挥改善认知功能作用的主要成分，挖掘更多可能的作用机制。
结果：
1.水迷宫结果：给药前（0d）与空白组比较，模型组逃避潜伏期明显延长，但穿越平台次数无统计学差异（P＞0.05）。给药7d后，与空白组比较，模型组及低、中、高剂量组（LD/MD/HD）小鼠的学习记忆能力明显减退（P＜0.01）但SCPE对学习记忆能力的改善程度不明显。给药14d后，SCPE表现出明显改善学习记忆的功能（P＜0.01）。给药21d、28d后SCPE可以改善小鼠的学习记忆能力，并与给药剂量呈正相关（P＜0.01）。神经病理结果：与空白组比较，模型组海马CA1~CA3区的神经元数量显著减少，并呈现出变性、坏死、淀粉样物质大量沉积、尼式体数量减少及脱颗粒化等异常病理改变。不同剂量的SCPE干预后，上述病理改变得到改善，其中以高剂量组表现明显。TUNEL染色结果：与空白组相比，模型组海马CA1~CA3区TUNEL阳性细胞数及比值显著增加（**P＜0.01）；与模型组比较，SCPE低、中、高剂量组海马CA1~CA3区TUNEL阳性细胞数量显著减少（＃＃P＜0.01），比值明显降低（＃＃P＜0.01），在一定程度上具有剂量依赖性。ELISA结果：与空白组相比，模型组小鼠血清中炎症介质IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，SCPE不同剂量给药28d后均能不同程度的降低小鼠血清中炎症介质IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平，且高剂量组（HD）相对表现最为明显。其中IL-6、IL-18水平的变化与SCPE的给药剂量呈较强的相关性。WB结果：与空白组相比，模型组海马中的NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、Aβ的蛋白表达水平显著增高（P＜0.01）。在连续灌胃SCPE28d后，各剂量组的海马组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、Aβ蛋白表达均表现为不同程度的下调，且高剂量组更为明显。
2.经代谢组学分析后，我们共发现84个MCI的生物代谢标志物，包括血管紧张素、白三烯D4、十六烷二酸、(3z,6z)3,6-壬二烯醛、异丙肾上腺素、D-鸟氨酸、甲氧胺、瓜氨酸、松柏醛、异丙基苹果酸、L-鼠李树胶糖、N-乙酰基-L-组氨酸、洋姜荽苷、精氨酸、鸟氨酸、2-异丙基苹果酸、L-亮氨酸、γ-谷酰基-硒甲基硒代半胱氨酸、木二糖、L-正亮氨酸等。对代谢物分析后获得与MCI相关的主要代谢通路8条，分别为：D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢通路；丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢通路；苯丙氨酸代谢通路；精氨酸和脯氨酸代谢通路；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成；半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路；氨酰tRNA生物合成；D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢通路。其中低剂量的SCPE可以回调40个代谢标志物，包括：十六烷基二酸、二十碳二烯酸、异亮氨酸、白三烯D、顺式-11-二十碳烯酸、苯丙氨酸、异丙基苹果酸、反式肉桂酸、N1-盐酸乙酰精胺、苯丙氨酸、赤霉素A15开放内酯等。对代谢物分析后获得4条代谢通路：苯丙氨酸代谢通路；丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢通路；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成；D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢通路。中剂量的SCPE可以回调48个生物代谢标志物包括：十六烷基二酸、二十碳二烯酸、异亮氨酸、白三烯D、顺式-11-二十碳烯酸、反式肉桂酸、N1-盐酸乙酰精胺、苯丙氨酸、赤霉素A15开放内酯、左旋肉碱、4-羟基异环磷酰胺、血管紧张素、16-羟基十六烷酸、蓖麻油酸、5-羟丁二乙酸、甲地嗪、L-亮氨酸。对代谢物分析后获得4条主要的代谢通路：苯丙氨酸代谢通路；丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢通路；半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路；D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢通路。高剂量的SCPE可以回调54个生物代谢标志物包括：十六烷基二酸、异亮氨酸、白三烯D、顺式-11-二十碳烯酸、异丙基苹果酸、反式肉桂酸、N1-盐酸乙酰精胺、苯丙氨酸、赤霉素A15开放内酯、左旋肉碱、4-羟基异环磷酰胺、甲地嗪、哌啶、1-苯基-1,2-丙二酮、邻甲酚、LysoSM(d18:1)、顺-3,顺-6-壬二烯醛、α-生育三烯酚、甘露醇-1-磷酸盐、β-酪氨酸、正亮氨酸、2-异丙基苹果酸、羟甲基戊二酸。对代谢物分析后获得4条主要的代谢通路为：苯丙氨酸代谢通路；丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢通路；半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路；D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢通路。
3.运用系统药理学手段，按ADMET（吸收/分布/代谢/排泄/毒性）的模型筛选出孔圣枕中丹中28个符合OB≥30%、DL≥0.1、BBB≥-0.3的活性成分，预测相应的靶点有84个；收集到与MCI存在直接、间接联系的靶蛋白并与孔圣枕中丹潜在靶点取交集共获得72个靶蛋白库。使用Cytoscape3.7.1软件构建“药物-成分-靶点-疾病”的MCTD网络，分析孔圣枕中丹的配伍机制为：君药为石菖蒲；臣药为远志；佐药为龟甲；使药为龙骨。活性最强的三种活性化合物分别是来自石菖蒲的2-O-甲基异甘草甙元和别香橙烯以及来自远志的1,6－二羟基－3,7－二甲氧基呫吨酮，最关键的三个靶点分别为PTGS2、GABRA1、CHRM1。将SCPE干预MCI的72个靶蛋白导入STRING数据库构建蛋白互作网络，并运用Cytoscape3.7.1软件进行可视化处理及拓扑分析，筛选出度及介数均大于各自平均数的重要靶点15个，由PPI网络图可直观发现排在前三位的靶点分别为TP53、NOS3、CASP3。采用DAVID、Metascape、JTreView平台分别对PPI网络中筛选出的15个关键靶点做Heatmap、GO、Kegg分析发现SCPE干预MCI参与的主要GO条目有调节血液循环、突触膜的组成及突触传递、有机羟基化合物的转运、多细胞生物的体内平衡、对有毒物质的反应等过程；Kegg条目有受体配体作用的神经活性、cGMP-PKG信号通路、cAMP信号通路、前列腺癌、吗啡成瘾、甲状腺激素信号通路、p53信号通路、IL-17信号通路等。
结论：
1.孔圣枕中丹可以通过抑制Aβ蛋白沉积及调节经典的细胞焦亡NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路发挥改善轻度认知障碍的药理作用。孔圣枕中丹改善认知功能具有较为明显的量效关系，以高剂量的作用效果最为明显。
2.轻度认知障碍的发病机理可能是由于脑组织中血管紧张素、白三烯D4、十六烷二酸等代谢标志物含量的变化，影响D-精氨酸和D-鸟氨酸代谢；丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢；苯丙氨酸代谢；精氨酸和脯氨酸代谢；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成；半胱氨酸和蛋氨酸代谢；氨酰tRNA生物合成；D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢异常所致。
3.孔圣枕中丹改善轻度认知障碍的作用机理主要是通过回调十六烷基二酸、二十碳二烯酸、异亮氨酸等代谢标志物的水平，调控苯丙氨酸代谢、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢通路。
4.孔圣枕中丹可以通过2-O-甲基异甘草甙元、别香橙烯以及1,6－二羟基－3,7－二甲氧基呫吨酮等活性成分作用于关键靶点PTGS2、GABRA1、CHRM1、TP53、NOS3、Caspase-3调控受体配体作用的神经活性及cGMP-PKG等信号通路发挥改善认知功能的作用，表明孔圣枕中丹治疗轻度认知障碍的“多组分-多靶点-多通路”协同关联的作用机制。