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炭疽叶枯病(Glomerellaleafspot,GLS)是近年来我国苹果上新发现的一种叶部病害,导致苹果早期大量落叶和果实严重病斑,给苹果生产造成重大威胁。尽管炭疽叶枯是新发现的一种病害,目前已蔓延至各苹果产区。炭疽叶枯菌遗传多样性研究可以了解病原菌的群体结构、遗传多样性、病原菌适应机制、病害的发展趋势,为炭疽叶枯病的综合治理提供理论依据。 利用10条ISSR引物对山东、陕西、江苏、河南的135株菌株炭疽叶枯菌株进行遗传多样性分析,10条引物共扩增出95个位点的多态性条带,多态率是95.96%。STRUCTURE分析结果表明,采自五个不同地区的炭疽叶枯菌在遗传上划分为五个不同的组群。通过对五个地理组群的遗传结构分析发现,山东寺口组群(H=0.2534,I=0.3752)和江苏丰县组群(H=0.2072,I=0.3135)遗传多样性最高,河南商丘组群(H=0.1304,I=0.1998遗传多样性最低),五个组群的遗传分化系数(Gst)是0.3251。AMOVA分析结果表明,地区间的变异仅占总变异度的6.41%,组群间的变异度占36.07%,组群内变异度占57.52%,表明病菌的变异主要来自组群内。五个组群群体间的基因流是1.0379,表明炭疽叶枯菌在组群间存在一定的交流。同一地区内,自嘎啦品种采集菌株的多样性比金帅品种采集菌株的多样性高。 对采自山东牟平嘎啦果园的炭疽叶枯菌株030206进行了全基因组测序。结果表明,该菌株全基因组大小是59.59Mb,10505个基因,982个SSR位点。用Primer3软件设计838条引物,从中筛选出了25条SSR引物,并用FAM,HEX,ROX和TAMRA进行荧光标记。用25条SSR引物分析了栖霞、牟平、沂水、茌平、沾化等地96个炭疽叶枯病菌的遗传多样性。结果表明,96个菌株Neis基因多样性指数(H)为0.343,Shannon指数(I)为0.593。STRUCTURE分析结果表明,96个菌株可以被划分3个不同的组群,组群一(GC1)主要分布在山东西部,组群二(GC2)和组群三(GC3)主要分布于山东东部。AMOVA分析表明,群体间的变异度占总变异度的15%,群体内变异度占85%,炭疽叶枯菌组群内和组群间的都存在变异,其中组群内的变异大于组群间的变异。 从三个组群中分别选取四个菌株YS01(GC1)、LC020101(GC1)、MP010202(GC2)和HY060202(GC3)评估其寄生适合度。结果表明,在嘎啦和金冠品种上,菌株YS01侵染形成的病斑个数最多,潜育期最短,产孢量最大,寄生适合度最强;菌株MP010202侵染形成的病斑数最少,潜育期最长,产孢量最少,寄生适合度最低。将四个菌株的分生孢子等量混合后,接种到离体和活体的苹果叶片上后,经连续5代的继代培养后,取病斑上产生的分生孢子用SSR检测,发现接种到离体嘎啦和活体金冠叶片上的四株炭疽叶枯病菌,经连续5代的培养后,只有菌株YS01(GC1)存活下来;而接种到活体嘎啦叶片上四个菌株,没有一个能存活下来,病叶上所检测到的24个菌株与所接种的四个菌株都不同;接种到离体富士叶片上的四个菌株,只有菌株YS01(GC1)存活下来,但在分离的24个菌株中,23个菌株都不同于原来的接种菌株。 用10条ISSR引物检测了由单个菌株有性生长产生的8个子囊孢子的遗传多样性,来自同一个子囊的8个子囊孢子中,其中7个子囊孢子的多样性与亲代完全相同,由10条引物扩增出的多态性位点的数量和大小全一致;其中1个子囊孢子的多样性与亲代及其他7个子囊孢子的多样性不同,由816引物扩增出片段中,比亲代和其7个子囊孢子多出1个多态性条带。选取来自同一菌株有性生殖产生的一对正负菌株对峙培养,正负菌株交配产生子囊孢子后,再从子囊孢子中选取一对正负菌株对峙培养,继代培养5代后,用ISSR引物对每一代菌株的多样性进行检测,发现在有性生殖中,病菌的多样性发生了变化,不同菌株间,扩增片段不完全相同。