论文部分内容阅读
目的:(1)从人群遗传流行病学角度,探讨NFKB1基因启动子区-94 ATTG插入/缺失突变在新疆汉族人群中的中分布和与冠心病发病和冠状动脉病变狭窄程度的关联性。(2)探讨NFKB1基因突变与冠心病发病相关因子eNOS、IL-6、IL-8、MDA和SOD的水平相关性。(3)从分子遗传学角度明确NFKB1基因突变在冠心病发病中的分子机制。方法:(1)采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,对1184例冠心病患者和1112例健康对照组NFKB1基因启动子区-94 ATTG插入/缺失突变位点进行基因型鉴定,并采用Logistic回归分析其与冠心病发病的关联性;采用Gensini评分和冠状动脉病变支数评价NFKB1基因突变与冠状动脉病变狭窄程度;(2)应用ELISA检测冠心病患者和健康对照组患者血浆中血管内皮功能因子eNOS、炎性因子IL-6、IL-8以及氧化应激损伤因子MDA和SOD的水平,探索NFKB1基因突变对血管内皮细胞功能、炎性反应和氧化应激损伤的影响。(3)分离培养人原代脐静脉内皮细胞(HUVECs),采用免疫荧光法检测vWF抗体表达及流式细胞仪检测CD31抗体表达鉴定分离培养细胞纯度;CCK-8法和流式细胞学技术检测氧化应激对NFKB1不同基因型HUVECs造成的损伤;Western blot、real-time PCR和免疫荧光标记法检测NFKB1不同基因型HUVECs中p50蛋白的表达水平及凋亡相关蛋白的表达;EMSA检测核转录因子p50的转录功能。结果:(1)(1)冠心病患者与健康对照组人群中NFKB1基因启动子区-94 ATTG插入/缺失突变三种基因型II、ID、DD的分布频率具有显著差异,冠心病患者DD基因型分布频率在冠心病患者组显著高于健康对照组(18.2%vs.14.1%,P=0.016)。(2)冠心病患者与健康对照组人群中两种等位基因型I、D的分布频率具有显著差异,冠心病患者D等位基因分布频率在冠心病患者组中显著高于健康对照组(41.9%vs.37.9%,P=0.006)。(3)Logistic回归分析表明排除混杂因素影响后NFKB1基因突变与冠心病的发病存在关联性,NFKB1基因-94ATTG插入/缺失突变中DD基因型是冠心病发病的危险因素(OR=1.37,95%CI 1.087-1.726,P=0.008)。(4)冠心病患者中携带NFKB1基因突变DD基因型者冠状动脉狭窄程度较携带II或ID基因型的患者明显严重,并且病变支数也较多(Gensini评分:DD基因型为35.61±8.78分,ID基因型为26.86±7.58分,II基因型为25.95±7.2分,P<0.05;病变支数:DD基因型为2.42±0.32支,ID基因型为2.14±0.35支,II基因型为2.03±0.35支,P<0.05)。(2)(1)冠心病患者中携带NFKB1基因突变DD基因型者血浆eNOS的活性显著低于II或ID基因型携带者(DD基因型为15.85±3.15 ng/ml,ID基因型为20.55±3.74 ng/ml,II基因型为19.57±3.32 ng/ml,P<0.05);(2)冠心病患者中携带NFKB1基因突变DD基因型者血浆IL-6的水平显著高于II或ID基因型携带者(DD基因型为4.23±1.05 pg/ml,ID基因型为3.62±1.05 pg/ml,II基因型为3.59±1.08 pg/ml,P<0.05);(3)冠心病患者中携带NFKB1基因突变DD基因型者血浆SOD的水平显著低于II或ID基因型携带者(DD基因型379.56±6.02 pg/ml,ID基因型397.90±4.40 pg/ml,II基因型388.14±5.23 pg/ml,P=0.027)。(3)(1)实验中分离培养的人原代脐静脉内皮细胞比例较高,纯度为93.3%;(2)、NFKB1基因突变型HUVECs中p50蛋白表达水平显著低于野生型细胞;(3)突变型HUVECs中p50转录因子的转录功能显著低于野生型细胞。(4)NFKB1基因缺失突变引起氧化应激条件下NF-κB信号通路被异常激活,导致突变型HUVECs凋亡显著增加。(5)NFKB1基因缺失突变可显著上调炎性因子IL-6基因的mRNA表达,增加突变型脐静脉内皮细胞炎性反应。(6)NFKB1基因缺失突变可显著下调eNOS基因的mRNA表达,降低eNOS的活性,导致突变型HUVECs功能障碍更加显著。结论:(1)NFKB1基因启动子区-94 ATTG插入/缺失突变与冠心病的发病和冠状动脉病变程度存在关联,DD基因型是冠心病发病的危险因素。(2)NFKB1基因突变可引起内皮细胞功能障碍、增加机体炎性反应和氧化应激损伤。(3)NFKB1基因突变可降低HUVECs中NF-κB信号通路中关键亚基p50蛋白的表达,并且降低p50转录因子的转录功能。(4)NFKB1基因缺失突变引起氧化应激条件下NF-κB信号通路被异常激活,导致突变型HUVECs凋亡显著增加。(5)NFKB1基因缺失突变可显著上调炎性因子IL-6基因的mRNA表达,增加突变型脐静脉内皮细胞炎性反应。(6)NFKB1基因缺失突变可显著下调eNOS基因的mRNA表达,降低eNOS的活性,导致突变型HUVECs功能障碍显著明显于野生型细胞。由此可知,NFKB1基因启动子区-94 ATTG缺失突变可能通过降低NF-κB信号通路p50亚基的表达和转录功能,诱导机体炎性反应增加、内皮细胞功能障碍和凋亡从而增加冠心病的易感性。