纳米科学、信息科学和生命科学并称为21世纪的三大支柱科学领域。人们在逐渐认识纳米技术的优点和潜在的巨大市场的同时,一个新的科学问题暨社会问题--纳米材料的生物效应和安全性问题也逐渐凸显出来,引起科学界和各国政府的高度重视。纳米铜是粒径达纳米级的铜颗粒,是典型的人造纳米材料。纳米铜在工业领域应用广泛,在生物医药领域也显示出良好的应用前景。虽然纳米铜与人类的关系日益密切,但有少量研究资料提示纳米铜对人类和环境可能存在危害。然而,截止目前,关于纳米铜的生物安全性研究仍然存在不全面、不深入的问题。可概括为:研究主要集中在急性毒性评价方面,对毒性机制的研究未见报道,有必要进一步探索纳米铜的重复暴露毒性特点和毒性机制。因此,针对上述问题,本课题依据系统毒理学的研究思路,一方面,利用传统毒理学的方法进一步观察纳米铜重复染毒后的毒理学效应,揭示纳米铜的潜在靶器官,包括纳米铜对大鼠体重和脏器系数的影响、对临床生化指标的影响、对组织病理学的影响等;另一方面,利用现代组学技术,包括基因组学和蛋白质组学技术,从基因和蛋白层面探讨纳米铜的毒性作用机制;最后,将两部分的结果进行整合分析,从而获得较为全面的纳米铜毒效应特征;最终为纳米铜的安全性评价、毒性监测及干预提供理论依据。整个研究过程以微米铜为对照,便于观察纳米铜特殊的毒理学效应。具体研究内容和结果如下:选择经口染毒雄性Wistar大鼠5天的暴露方式观察纳米铜的重复毒性特点,结果发现,200mg/kg纳米铜能够引起大鼠出现体重降低、腹泻、精神萎靡、对外界刺激反应减弱、自主行为失调,呼吸减弱和震颤等毒性表现。可导致大鼠血清生化指标ALT、AST、TBA、TBILI、TG、TP、CREA和BUN水平明显升高, TCHO和ALP水平明显降低;肝细胞出现散在的点状或小灶性坏死;肾小管上皮细胞出现广泛变性坏死,损伤部位主要位于肾皮质和皮髓交界区。在纳米铜50,100 mg/kg/d组,仅发现大鼠血清TG和TCHOL明显升高,肾近曲小管上皮细胞出现轻度肿胀。纳米铜50mg/kg/d接近观察到有害效应最低水平。而在微米铜200 mg/kg/d处理组,未发现大鼠血清生化指标发生明显异常,仅发现少数大鼠肾近曲小管上皮细胞出现轻度肿胀。随机选取亚急性毒性试验中溶剂对照组、微米铜200mg/kg组、纳米铜100mg/kg组和纳米铜200mg/kg组三只动物的肝脏和肾脏进行基因组学研究,每个脏器对应一张大鼠全基因组芯片。结果发现:在肝脏组织中,200mg/kg纳米铜引起大鼠肝脏发生差异改变的基因涉及的生物学过程主要包括:应激反应、物质和能量代谢、电子转移和细胞增殖调节等方面。这些差异基因涉及的KEGG通路有:细胞粘附分子、信号转导、抗原加工和提呈、细胞因子与受体的相互作用、细胞色素P450对外源物质的代谢以及物质和能量代谢等。而在微米铜200mg/kg组大鼠肝脏中发生差异改变的9个基因并未形成大于两个基因聚集的生物学过程、分子功能和KEGG通路。在肾脏组织中,200mg/kg纳米铜引起大鼠肾脏发生差异改变的基因涉及的生物学过程主要包括:物质和能量代谢、生物学调节、物质转移、应激反应、发育过程、细胞的增殖、分化和死亡等。这些差异基因涉及的功能通路包括:支链氨基酸降解、细胞周期、氧化磷酸化、脂肪酸代谢、细胞色素P450对外源物质的代谢、补体和凝血级联以及多种物质和能量代谢等。部分差异基因的Realtime PCR研究结果与基因组学结果基本一致,证实了基因组学研究结果的可信性。取与基因组学研究相对应的微米铜和纳米铜不同剂量处理组大鼠肝脏和肾脏组织样本各四个,利用差异凝胶电泳和质谱技术进行蛋白质组学研究,结果发现:在肝脏组织中,纳米铜高剂量组共鉴定出19个差异蛋白,分别是碳酸酐酶3、过氧化氢酶、谷胱甘肽S-转移酶等;纳米铜高低剂量组均发生表达改变的共鉴定出7个,分别是精氨基琥珀酸合成酶、异柠檬酸脱氢酶、羟甲基戊二酰辅酶A合酶等;微米铜组共鉴定出3个,分别是角蛋白8、角蛋白18和钙网织蛋白。将所鉴定的差异蛋白按功能进行分类,在纳米铜200mg/kg组,差异蛋白涉及氧化应激反应、氮素代谢、谷光苷肽代谢等过程。在纳米铜200mg/kg组和纳米铜100mg/kg组均发生差异改变的蛋白涉及代谢产物前体和能量的生成、对细胞外刺激的反应等过程。在肾脏组织中,纳米铜高剂量组共鉴定出54个差异蛋白,包括:谷胱甘肽过氧化物酶3、ATP合成酶β亚单位、钙调蛋白等;纳米铜高低剂量组均发生表达改变的差异蛋白共鉴定出19个,包括:异柠檬酸脱氢酶、泛醇-细胞色素C还原酶、电子传递黄素蛋白α亚单位等。而在,微米铜组并未发现有差异改变的蛋白。将所鉴定的差异蛋白按功能进行分类,在纳米铜200mg/kg组,差异蛋白涉及氧化磷酸化、氧化应激的反应、三羧酸循环、尿素循环和氨基代谢、细胞稳态和细胞骨架组建等功能类别。在纳米铜200mg/kg组和纳米铜100mg/kg组均发生差异改变的蛋白涉及氧化磷酸化、对金属金属离子的反应和三羧酸循环等过程。肝脏差异蛋白过氧化氢酶和碳酸酐酶3以及肾脏差异蛋白辅酶Q和钙调蛋白的Western blotting结果与蛋白质组学的结果基本一致,证实了蛋白质组学结果的可信性。采用TBA比色法和DTNB显色法进一步对大鼠肝脏和肾脏组织中的巯基和MDA含量进行检测,结果证实了氧化应激反应确实在纳米铜引起的肝脏和肾脏毒性中起到重要作用。结合本实验室前期的代谢组学研究结果,将有关纳米铜毒性机制的基因组学、蛋白质组学和代谢组学数据进行综合分析发现,纳米铜在这三个层面上引起的毒性改变基本趋于一致。在大鼠肝脏中,在基因组、蛋白质组和代谢组水平都有与三羧酸循环和尿素循环与氨基代谢密切相关的基因、蛋白质和代谢物发生改变。此外,氧化应激反应、谷胱甘肽代谢、电子转移和酮体的生成和降解等功能通路中也都显示出基因和蛋白质变化的一致性。在大鼠肾脏中,在基因组、蛋白质组和代谢组水平都有与三羧酸循环、糖酵解和糖异生、以及尿素循环与氨基代谢密切相关的基因、蛋白质和代谢物发生改变。在氧化磷酸化、细胞内钙离子稳态和谷胱甘肽代谢等功能通路也都有相应的基因和蛋白发生一致性的改变。因此,可以推断这些功能通路在纳米铜引起的大鼠肝脏和肾脏损伤中发挥了重要作用,同时也证明了组学技术在纳米材料的毒理学研究,即纳米毒理学研究中的综合运用具有可行性。综合以上研究结果,我们初步得出以下结论:纳米铜经口反复染毒大鼠5天,肝脏和肾脏是纳米铜的主要毒性靶器官;50 mg/kg/d接近观察到有害作用的最低水平(LOAEL);同等条件下,纳米铜的毒性明显高于微米铜。这可能与其小尺寸、大比表面积有关。氧化应激反应是纳米铜引起肝脏和肾脏损伤的重要途径之一。能量代谢障碍,尤其是三羧酸循环和氧化磷酸化过程的抑制可能是纳米铜引起肝、肾毒性的又一重要机制。细胞内钙离子稳态的失衡也参与了纳米铜引起的肾脏损伤。上述功能通路中发生差异改变的相关基因和蛋白可作为研究纳米铜诱发肝、肾损伤的候选生物标志物。基因组学和蛋白质组学技术结合传统毒理学方法应用于纳米毒理学研究,在了解纳米材料的毒性特点和毒性机制方面具有较大优势。