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钙离子(Ca2+)是细胞内广泛存在的第二信使,调控细胞的各种重要生理功能,如细胞的增殖分化、能量代谢、自噬、凋亡等过程。在静息状态下,细胞质内游离的Ca2+浓度约为100 n M,但线粒体、内质网等钙池中的Ca2+浓度可达几百μM。胞质与细胞器之间这种陡峭的Ca2+浓度梯度的维持和细胞内Ca2+稳态的实现,依赖于细胞内各种Ca2+通道、转运体以及钙调蛋白的相互协调作用。一旦细胞的Ca2+稳态被打破,就可能引发疾病。研究证实多种病毒可通过调控细胞的钙通道或钙水平,促进自身的感染与复制,而且轮状病毒调控钙通道与其感染动物后引起的呕吐、腹泻等临床表现密切相关。PDCoV是最近几年发现的新型猪肠道冠状病毒,主要引起仔猪的呕吐、腹泻、脱水甚至死亡,给养猪业造成了严重的经济损失。但PDCoV感染是否通过调控钙通道与钙水平以促进自身的复制与致病,目前尚无报道。鉴于此,本论文对Ca2+在PDCoV感染中的作用开展了研究,主要研究内容如下:1. PDCoV感染上调胞浆Ca2+浓度将PDCoV感染装载有Ca2+探针Fluo-3AM的LLC-PK1细胞和IPI-2I细胞,于感染后每5 min检测胞浆Ca2+浓度,发现PDCoV感染两种细胞后分别于80 min和120 min开始上调胞浆Ca2+浓度。进一步在IPI-2I细胞上延长检测时间发现,PDCoV感染后2-12 h内均上调胞浆Ca2+浓度,提示PDCoV可能通过上调胞浆Ca2+浓度促进自身的感染。2. 螯合细胞外Ca2+抑制PDCoV的复制用含不同浓度EGTA的培养液处理IPI-2I细胞,于PDCoV感染后6 h和12 h收样检测发现,PDCoV m RNA拷贝数、N蛋白的表达和病毒滴度均显著降低,说明EGTA螯合胞外Ca2+后可抑制PDCoV的复制。为了确定EGTA对PDCoV增殖的影响,在用EGTA处理细胞后,添加不同浓度的Ca Cl2以补充胞外Ca2+,空斑检测发现添加Ca Cl2后可部分恢复EGTA介导的PDCoV增殖滴度的降低。进一步用无钙培养基培养PDCoV,发现在没有Ca2+的情况下PDCoV的增殖明显受到抑制。这些结果说明细胞外Ca2+在PDCoV的感染过程中起着重要的作用。3. Ca2+通道抑制剂和胞内Ca2+螯合剂抑制PDCoV复制用盐酸地尔硫卓(细胞膜L型钙离子通道抑制剂)、2-APB(内质网IP3R通道抑制剂)、盐酸苄普地尔(长效且无选择性钙离子通道抑制剂)和BAPTA-AM(细胞内钙离子螯合剂)分别处理细胞,于PDCoV感染后6 h和12 h分别收样,检测病毒的m RNA拷贝数、N蛋白的表达以及病毒滴度,发现这几种抑制剂均明显抑制PDCoV的复制,但以盐酸地尔硫卓的作用最显著。4. 盐酸地尔硫卓抑制PDCoV感染过程中的复制阶段由于盐酸地尔硫卓对PDCoV感染的抑制效果最为明显,因此对其抑制PDCoV感染的具体机制进行了深入研究。通过检测盐酸地尔硫卓对PDCoV是否存在直接的灭活作用和对PDCoV吸附、侵入、复制和释放等环节的影响后发现,盐酸地尔硫卓抑制PDCoV感染主要是降低了病毒负链RNA的合成,即抑制了PDCoV感染过程中的复制阶段。5. 干扰CACNA1S抑制PDCoV复制L型钙离子通道包括CACNA1S、CACNA1C、CACNA1D和CACNA1F四种,检测发现在IPI-2I细胞上CACNA1S表达量明显高于其它三种,推测CACNA1S在PDCoV感染中可能发挥关键的作用。于是利用表达CACNA1S干扰分子的慢病毒分别转导IPI-2I和LLC-PK1细胞,然后接种PDCoV,通过对PDCoV m RNA水平和蛋白水平的表达及病毒滴度的检测发现,与对照相比,干扰CACNA1S后PDCoV的复制受到明显的抑制。说明L型钙离子通道在PDCoV感染过程中发挥着重要的作用。