龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是我国南方一种重要的热带亚热带果树。植物在生长发育过程中，为了消除逆境及自身生理代谢所带来的有害的自由基和活性氧，自身的保护酶系统将发挥其巨大作用。SOD是保护酶系统中第一个发挥作用的抗氧化酶，不同类型的SOD基因会随着植物生长过程以及外界环境或因子的变化而出现差异表达。在前人研究的基础上，本研究从16个龙眼品种诱导胚性愈伤组织（embryogenic callus，EC），进行龙眼EC在离体保存、非生物胁迫条件及多种激素处理下EC SOD在转录和蛋白（酶活性）水平的变化检测；采用转化烟草的方法，进行不同类型SOD不同缺失片段的启动子的SOD启动子功能鉴定研究，并进一步进行龙眼EC转化体系的优化研究，为进一步探讨龙眼EC SOD的功能与作用机制，并为今后利用转基因技术直接转化龙眼提供参考。主要研究结果如下：1龙眼胚性愈伤组织的诱导及其限制生长保存条件下的生长状况比较本研究首先对福建省的龙眼主要栽培品种及地方品种进行胚性愈伤组织的诱导，其中7个品种是采自泉州农科院的地方品种，包括‘泉龙160（柴螺系列）’、‘泉龙313（东壁系列）’、‘石硖’、‘泉龙138（乌龙岭系列）’、‘泉龙142’、‘东壁’和‘泉龙114（储良系列）’；另外9个品种是采自莆田果树所的栽培品种，包括‘03晚优’、‘松风本’、‘莆田-石硖’、‘油潭本’、‘龙优’、‘莆田-东壁’、‘云本’、‘青壳宝圆’和‘鸡蛋本’。结果显示，16个品种的龙眼EC均已诱导得到，随后比较限制生长条件下不同品种龙眼EC的生长情况，结果表明11个品种的龙眼EC生长状况相对比较良好并能延长其继代周期到50d，包括‘红核子’、‘龙优’、‘松风本’、‘油潭本’、‘青壳宝圆’、‘云本’、‘鸡蛋本’、‘泉龙313（东壁系列）’、‘泉龙142’、‘泉龙160（柴螺系列）’、‘泉龙114（储良系列）’。另外6个品种的龙眼EC生长状况相对较差并不能延长继代周期到50d，包括‘石峡’、‘东壁’、‘莆田-东壁’、‘莆田-石峡’、‘03晚优’、‘泉龙138（乌龙岭系列）’。2龙眼EC SOD在不同生理条件下的酶活性变化2.1限制生长保存和普通保存过程中的EC的SOD活性变化以红核子、云本、石峡EC为试材，它们在常规保存和限制保存培养基上的SOD活性变化检测结果显示，限制保存能有效延缓龙眼EC的衰老，能明显推迟了SOD活性峰值出现的时间，红核子和云本的SOD活性峰值可以由常规保存时的30d推迟至50d，而限制保存较不理想的石峡也由30d推迟至40d，结果还显示SOD活性峰值出现的时间又与龙眼本身的耐衰老能力有关。2.2不同非生物胁迫及激素处理下龙眼EC的SOD活性变化2.2.1龙眼EC在非生物胁迫中的SOD酶活性变化本研究检测了聚乙二醇（PEG）、甘露醇、蔗糖、NaCl、不同光质的非生物胁迫下龙眼EC的SOD酶活性变化，结果表明：与对照相比，随着PEG胁迫强度的增加，SOD活性在轻度(10%PEG)、中度(20%PEG)胁迫下上升，严重(30%PEG)胁迫下呈快速下降趋势；随着甘露醇浓度的提高，SOD活性不断升高，且一直维持在一个较高的水平上，直到浓度达到100g/L时才开始呈现缓慢下降的趋势；随着蔗糖浓度的升高，SOD活性不断升高，直到蔗糖浓度为70g/L时开始下降，70~90g/L之间的SOD活性下降缓慢。甘露醇和蔗糖处理比PEG处理的SOD活性高，下降的速度也较缓慢，说明适当高浓度的甘露醇和蔗糖，可以有效提高植物细胞活力，从而延缓细胞衰老，为龙眼EC离体保存以及提高龙眼的抗旱性等应用提供了重要科学依据。随着NaCl浓度的升高，低盐胁迫下SOD酶活性先上升后下降，而高盐胁迫下SOD酶活性则呈下降趋势，低盐胁迫下SOD酶通过迅速增加活力来保护细胞，在防止盐胁迫伤害中起到很重要的作用。不同光质分别处理24h、72h，发现随着时间的延长，龙眼EC的SOD活性逐渐上升，在同样的光强和处理时间下，白光下的SOD活性是最强的，红光次之，说明白光可以有效诱导SOD活性的提高，而蓝绿光下的SOD活性接近于对照。2.2.2龙眼EC在激素处理中的SOD酶活性变化乙烯利、IAA、赤霉素、茉莉酸甲酯处理的龙眼EC的SOD活性变化均呈先升后降趋势，乙烯利的峰值出现在30ppm，IAA出现在1.5mg/L时，赤霉素的峰值保持在6~12mg/L间，茉莉酸甲酯出现在100μmol/L时，而水杨酸是升-降-升趋势，分别在50μmol/L和100μmol/L时出现峰值，以上激素处理的峰值均显著高于对照，说明植物激素可能通过提高龙眼EC的SOD活性以增强抗逆性。3龙眼EC SOD在不同生理条件下表达的定量PCR分析3.1龙眼EC在离体保存过程中SOD表达的定量PCR分析以EF-1a、eIF-4a、DlFSD1a为内参基因，用SYBR GreenⅡ荧光染料法的荧光定量PCR法检测常规继代保存过程中龙眼EC的DlCSD1a、DlFSD1a、DlMSD基因的转录水平，结果显示，保存25d时DlCSD1a表达量上升最显著，DlMSD次之，DlFSD1a有小幅度下降；30d时DlCSD1a和DlMSD保持稳定，DlFSD1a大幅度上升；40d后3类基因表达量均下降，说明材料有所老化。说明保存20~30d，龙眼EC的生长主要由不同SOD基因间相互协调，此消彼长，相互调控，以维持龙眼EC SOD的动态平衡，DlCSD1a一直发挥着主要调控作用，DlMSD保持在较高的稳定水平，保存30d时DlFSD1a在抗衰老方面发挥重要作用。3.2龙眼EC在非生物胁迫及激素处理中SOD表达的定量PCR分析3.2.1龙眼EC在非生物胁迫中SOD表达的定量PCR分析以EF-1a、eIF-4a、DlFSD1a为内参基因，用SYBR GreenⅡ荧光染料法的荧光定量PCR法检测蔗糖、NaCl和不同光质的非生物胁迫处理下龙眼EC的DlCSD1a、DlFSD1a、DlMSD基因的转录水平，结果显示，在蔗糖处理下，DlCSD1a起最大作用，DlMSD次之，DlFSD1a保持稳定；不同光质分别处理24h、72h，3类基因的表达量大致为白光＞红光＞蓝光＞绿光，处理24h时DlCSD1a起主要作用，但随着光质处理时间的延长，其表达量大幅度降低，而DlFSD1a表达量得到提高，DlMSD一直无明显表达；在盐胁迫下，DlCSD1a的上调表达最显著，DlMSD次之，DlFSD1a基本保持不变。3.2.2龙眼EC在激素处理中SOD表达的定量PCR分析以EF-1a、eIF-4a、DlFSD1a为内参基因，用SYBR GreenⅡ荧光染料法的荧光定量PCR法检测水杨酸、乙烯利、IAA、赤霉素、茉莉酸甲酯激素处理下龙眼EC的DlCSD1a、DlFSD1a、DlMSD基因的转录水平，结果显示，DlCSD1a对水杨酸、IAA、赤霉素、茉莉酸甲酯均起到主要应答作用，表达峰值分别出现在水杨酸75μmol/L、IAA1.5mg/L、赤霉素12mg/L和茉莉酸甲酯50μmol/L时，DlFSD1a对乙烯、赤霉素无明显应答，而DlMSD基因对乙烯有显著应答，峰值出现在乙烯30ppm。4龙眼EC不同SOD启动子的功能鉴定研究4.1农杆菌注射渗透法转化烟草叶片的体系优化对影响农杆菌注射转化烟草叶片法的多项因素进行了优化，结果表明，应选择移栽1个月左右的生长健壮、扎根较深且无枯叶、黄叶的烟草植株作为受体材料，以叶脉侧脉位置作为试验的侵染部位，农杆菌重悬菌液浓度OD600值为0.85，在20mmol/LMgCl2重悬液添加200μmol/L的乙酰丁香酮，注射3d后进行瞬时表达检测。对该体系进行优化后，将该方法应用于启动子的功能鉴定中我们发现其瞬时表达率明显提高，且数据稳定，重复性好。4.214个3’/5’端序列缺失片段SOD启动子转化烟草叶片及其瞬时表达分析GUS基因的瞬时表达结果显示，DlMSD启动子不同3’/5’端缺失片段中MSD-pro4的活性最强，是CaMV35S启动子的0.839倍，MSD-pro2最弱。DlFSD1a启动子不同3’/5’端缺失片段中FSD-pro4的活性最强，是CaMV35S启动子的0.887倍，FSD-pro2最弱。DlCSD1a启动子不同3’/5’端缺失片段中CSD-pro5的活性最强，是CaMV35S启动子的0.566倍，CSD-pro3最弱。综上，FSD-pro4是其中GUS活性最高的。4.3SOD启动子转化烟草叶片的GUS基因表达的定量PCR分析以18S rRNA为内参基因，用SYBR GreenⅡ荧光染料法的荧光定量PCR法检测不同类型SOD启动子不同缺失片段调控下烟草叶片GUS基因的相对表达量，结果显示DlMSD启动子不同3’/5’端缺失片段中MSD-pro4启动GUS基因的能力最强，MSD-pro3最弱；DlFSD1a启动子不同3’/5’端缺失片段中FSD-pro4最强，FSD-pro3启动子的能力最弱；DlCSD1a启动子不同3’/5’端缺失片段中CSD-pro5的活性最强，CSD-pro3最弱。与GUS瞬时表达检测结果一致的是FSD-pro4是其中启动GUS基因的能力最强的。5农杆菌介导转化龙眼体系的优化利用筛选出的启动GUS基因最强的FSD-pro4启动子，在前人已建立的农杆菌介导转化龙眼的基础上，采用GUS荧光活性检测法，进一步优化转化体系，以期能定量而准确地确定转化体系中多个因素，得到最优转化体系。以在2,4-D浓度0.3mg/L培养18d的龙眼EC作为受体材料，在添加了50μmol/L乙酰丁香酮的农杆菌侵染液中侵染25min，共培养5d，除菌时间为50min，后置于40mg/L潮霉素的培养基上进行抗性筛选。用微量提取法提取DNA，并对抗性EC进行PCR检测，结果表明GUS基因在龙眼抗性EC中获得了高表达，但是龙眼抗性EC生长较为缓慢，有待于将来进一步研究。