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目的:基于“脾肾相关”理论探讨补肾健脾方及其拆方促进大鼠BMSCs成骨分化的机制殖,揭示其通过促进骨形成而干预废用性骨质疏松的作用机制。材料与方法:SPF级大鼠38只,雄性,6周龄,体质量（220±10）g,将这批大鼠随机分为正常组、补肾组、健脾组和补肾健脾组,共4组,其中正常组14只（8只制备含药血清,6只制备骨髓间充质干细胞）,其余每组各8只。依据“人和动物体表面积比等效剂量换算比率”换算,给补肾组、健脾组和补肾健脾组大鼠灌胃,其药量为人口服用药的等效剂量,补肾组3.24g/kg、健脾组2.43g/kg、补肾健脾组5.67g/kg,正常组大鼠给予相同体积蒸馏水（其中用来制备骨髓间充质干细胞的6只大鼠不灌胃）,每天对需要灌胃的大鼠进行1次给药2ml,连续灌胃7d,在第7d灌胃后2h,对大鼠进行麻醉,手术剪刀消毒后剪开大鼠腹部,进行腹主动脉采血,将存有血液的离心管存放在室温中,静置2h后,离心机设置转速3000rpm,时间20min进行离心,吸取管中上清部分,使用针头滤器进行过滤、除菌、灭活、分装,最后放置在-80℃冰箱保存。将剩余6只正常组大鼠颈椎脱臼法处死后放置在75%的酒精里浸泡10min,纱布蘸取碘伏擦拭大鼠身体进行全面消毒2遍,保证无菌条件下进行取骨操作,将大鼠放置在超净台内,取出其股骨和胫骨,并剃净骨头上附着的肌肉筋膜组织,使用注射器吸取含10%胎牛血清的LG-DMEM培养液注射到骨髓腔中,进行反复冲洗,直到发现颜色变白停止冲洗,保证冲洗完全,将冲洗液放入离心机中,转速设置1000rpm,时间6min进行离心,去除脂肪层,之后放入200目滤网过滤,最终获得单细胞悬液,放置在CO2培养箱中,将骨髓间充质干细胞进行原代培养,培养至第三代。用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测各组成骨细胞增殖,筛选各组含药血清对骨髓间充质干细胞干预的最适浓度。分析检测后结果,按最适浓度值分为空白血清组（空白血清）,诱导组（成骨诱导液）,健脾含药血清组（健脾含药血清加成骨诱导液）,补肾含药血清组（补肾含药血清加成骨诱导液）,补肾健脾含药血清组（补肾健脾含药血清加成骨诱导液）培养骨髓间充质干细胞14天。ELISA法检测大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导3、7、14天后细胞上清液中碱性磷酸酶（ALP）活性,采用茜素红染色检测各组大鼠骨髓间充质干细胞矿化结节形成情况,采用蛋白质免疫印记技术（Western-blot）检测大鼠骨髓间充质干细胞中Smad1、P-Smad1、Smad5、P-Smad5、BMP-2、Osterix蛋白的表达。结果:1.不同浓度补肾健脾方及其拆方含药血清对BMSCs增殖活性的影响1.1不同浓度健脾方含药血清在不同时间点对BMSCs增殖活性的影响培养24小时,与5%空白对照血清组相比,5%健脾含药血清组细胞增殖活性显著升高（P＜0.01）;与10%空白对照血清组相比,10%健脾含药血清组细胞增殖活性显著升高（P＜0.01）;与20%空白对照血清组相比,20%健脾含药血清组的细胞增殖活性升高（P＜0.05）。培养48小时,与5%空白对照血清组相比,5%健脾含药血清组的细胞增殖活性显著升高（P＜0.01）;与10%空白对照血清组相比,10%健脾含药血清组细胞增殖活性显著升高（P＜0.01）;与20%空白对照血清组相比,20%健脾含药血清组的细胞增殖活性显著升高（P＜0.01）。培养72小时,与5%空白对照血清组相比,5%健脾含药血清组细胞增殖活性显著升高（P＜0.01）;与10%空白对照血清组相比,10%健脾含药血清组细胞增殖活性升高,但无显著性差异;与20%空白对照血清组相比,20%健脾含药血清组的细胞增殖活性升高,但无显著性差异。1.2不同浓度补肾方含药血清在不同时间点对BMSCs增殖活性的影响培养24小时,与5%空白对照血清组相比,5%补肾含药血清组细胞增殖活性无明显差异;与10%空白对照血清组相比,10%补肾含药血清组细胞增殖活性无明显差异与20%空白对照血清组相比,20%补肾含药血清组细胞增殖活性无明显差异。培养48小时,与5%空白对照血清组相比,5%补肾含药血清组的细胞增殖活性升高（P＜0.05）;与10%空白对照血清组相比,10%补肾含药血清组的细胞增殖活性显著升高（P＜0.01）;与20%空白对照血清组相比,20%补肾含药血清组细胞增殖活性显著升高（P＜0.01）。培养72小时,与5%空白对照血清组相比,5%补肾含药血清组的细胞增殖活性无明显差异;与10%空白对照血清组相比,10%补肾含药血清组细胞增殖活性升高（P＜0.05）;与20%空白对照血清组相比,20%补肾含药血清组细胞增殖活性无明显差异。1.3不同浓度补肾健脾方含药血清在不同时间点对BMSCs增殖活性的影响培养24小时,与5%空白对照血清组相比,5%补肾健脾含药血清组细胞增殖活性显著升高（P＜0.01）;与10%空白对照血清组相比,10%补肾健脾含药血清组细胞增殖活性显著升高（P＜0.01）;与20%空白对照血清组相比,20%补肾健脾含药血清组细胞增殖活性显著升高（P＜0.01）。培养48小时,与5%空白对照血清组相比,5%补肾健脾含药血清组的细胞增殖活性显著升高（P＜0.01）;与10%空白对照血清组相比,10%补肾健脾含药血清组细胞增殖活性显著升高（P＜0.01）;与20%空白对照血清组相比,20%补肾健脾含药血清组细胞增殖活性无明显差异。培养72小时,与5%空白对照血清组相比,5%补肾健脾含药血清组的细胞增殖活性显著升高（P＜0.01）;与10%空白对照血清组相比,10%补肾健脾含药血清组细胞增殖活性无明显差异;与20%空白对照血清组相比,20%补肾健脾含药血清组细胞增殖活性无明显差异。2.成骨诱导不同时间点补肾健脾方及其拆方含药血清对细胞上清液ALP含量的影响与空白血清组相比,成骨诱导3天、7天和14天的诱导组细胞上清液ALP含量明显升高（P＜0.01）;与诱导组相比,成骨诱导3天的补肾含药血清组和补肾健脾含药血清组细胞上清液ALP含量明显升高（P＜0.01）,成骨诱导7天和14天的健脾含药血清组细胞上清液ALP含量升高（P＜0.05）,成骨诱导7天和14天的补肾含药血清组和补肾健脾含药血清组细胞上清液ALP含量明显升高（P＜0.01）;与健脾含药血清组相比,成骨诱导7天的补肾含药血清组细胞上清液ALP含量明显升高（P＜0.01）,成骨诱导14天的补肾含药血清组细胞上清液ALP含量升高（P＜0.05）;与补肾健脾含药血清组相比,成骨诱导3天、7天和14天的健脾含药血清组细胞上清液ALP含量明显降低（P＜0.01）,成骨诱导7天和14天的补肾含药血清组细胞上清液ALP含量降低（P＜0.05）。3.补肾健脾方及其拆方含药血清对成骨诱导的BMSCs茜素红染色矿化结节形成的影响BMSCs成骨诱导14天,进行茜素红染色,可通过显微镜镜下观察。与空白血清组相比,诱导组可见矿化结节生成;与补肾含药血清组和健脾含药血清组相比,补肾健脾含药血清组矿化结节生成更为明显。4.补肾健脾方及其拆方含药血清对大鼠BMSCs中BMP-2表达的影响与空白血清组相比,诱导组BMP-2表达量显著增高（P＜0.01）;与诱导组比较,健脾含药血清组、补肾含药血清组和补肾健脾含药血清组BMP-2表达量显著增高（P＜0.01）;与健脾含药血清组比较,补肾含药血清组BMP-2表达量显著增高（P＜0.01）;与补肾健脾含药血清组比较,健脾含药血清组、补肾含药血清组BMP-2表达量显著降低（P＜0.01）。5.补肾健脾方及其拆方含药血清对大鼠BMSCs中smad1表达的影响与空白血清组相比,诱导组smad1表达量显著增高（P＜0.05）;与诱导组比较,健脾含药血清组、补肾含药血清组和补肾健脾含药血清组smad1表达量显著增高（P＜0.01）;与补肾健脾含药血清组比,健脾含药血清组、补肾含药血清组smad1表达量显著升高（P＜0.01）。6.补肾健脾方及其拆方含药血清对大鼠BMSCs中P-smad1表达的影响与空白血清组相比,诱导组P-smad1表达量显著增高（P＜0.01）;与诱导组比较,健脾含药血清组、补肾含药血清组和补肾健脾含药血清组P-smad1表达量显著增高（P＜0.01）;与健脾含药血清组比,补肾含药血清组P-smad1表达量显著增高（P＜0.01）;与补肾健脾含药血清组比,健脾含药血清组、补肾含药血清组P-smad1表达量显著降低（P＜0.01）。7.补肾健脾方及其拆方含药血清对大鼠BMSCs中smad5表达的影响与诱导组相比,健脾含药血清组和补肾健脾含药血清组smad5表达量显著降低（P＜0.01）;与健脾含药血清组相比,补肾健脾含药血清组smad5表达量显著降低（P＜0.01）。8.补肾健脾方及其拆方含药血清对大鼠BMSCs中P-smad5表达的影响与空白血清组比,诱导组P-smad5表达量显著增高（P＜0.01）;与诱导组比较,健脾含药血清组、补肾含药血清组和补肾健脾含药血清组P-smad5表达量显著增高（P＜0.01）;与健脾组含药血清比较,补肾含药血清组P-smad5表达量显著增高（P＜0.01）;与补肾健脾含药血清组比较,健脾含药血清组、补肾含药血清组P-smad5表达量显著降低（P＜0.01）。9.补肾健脾方及其拆方含药血清对大鼠BMSCs中Osterix表达的影响与空白血清组比,诱导组Osterix表达量显著增高（P＜0.01）;与诱导组比较,健脾含药血清组、补肾含药血清组和补肾健脾含药血清组Osterix表达量显著增高（P＜0.01）;与健脾含药血清组比较,补肾含药血清组Osterix表达量显著增高（P＜0.01）;与补肾健脾含药血清组比较,健脾含药血清组、补肾含药血清组Osterix表达量显著降低（P＜0.01）。结论:1补肾健脾方、健脾方和补肾方均能促进大鼠BMSCs成骨分化,以补肾健脾方作用为最优。2补肾健脾方促进大鼠BMSCs成骨分化的可能机制:调控BMP-2以激活Smad1/P-Smad 1/Smad 5/P-Smad 5/Osterix信号通路,调节成骨细胞蛋白的表达,促进骨形成和诱导成骨分化。健脾方和补肾方的作用机制与补肾健脾方相同。