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睾丸支持细胞(Sertoli cell，SC)位于曲细精管的基底膜上，具有调节精子形成，为生殖细胞发育提供结构，免疫以及营养支持等功能，在睾丸发育中也发挥着重要作用。褪黑素是一种胺类激素，影响细胞增殖、发育、凋亡、氧化应激等生理过程，但其对雏鸡睾丸支持细胞作用尚不清楚。因此，本文旨在研究褪黑素对雏鸡睾丸支持细胞增殖的影响及其潜在机制。本试验以原代分离培养并鉴定的雏鸡睾丸支持细胞为研究对象，使用CellCountingKit-8(CCK-8)、5-ethynyl-2’-deoxyuridine(EdU)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和WesternBlot技术检测褪黑素对雏鸡睾丸支持细胞的细胞活力、细胞增殖能力和增殖相关基因表达的影响；随后敲减抑制素α亚基(INHA)或使用PD98059阻断ERK信号通路，检测敲减INHA或阻断ERK信号通路后对褪黑素诱导的支持细胞增殖的影响。研究结果如下：
1、油红O染色、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫荧光法结果表明，实验中分离的细胞为雏鸡睾丸支持细胞。用1、10、100、1000nM浓度褪黑素分别处理细胞48h，CCK-8、RT-qPCR和WesternBlot结果显示，雏鸡睾丸支持细胞活力、增殖基因PCNA和CCND1mRNA和蛋白表达量显著上升(P＜0.05)；EdU结果显示，雏鸡睾丸支持细胞增殖能力极显著上升(P＜0.01)；根据结果选取1000nM褪黑素处理支持细胞，用于后续实验。
2、RT-qPCR和ELISA结果显示，褪黑素可显著上调INHA的表达水平(P＜0.05)。随后，利用三条不同序列siRNA转染细胞24h，利用qRT-PCR和ELISA方法筛选出最佳干扰序列。敲减INHA基因后，CCK-8结果显示，褪黑素诱导的雏鸡睾丸支持细胞活力显著下降(P＜0.05)；EdU、qRT-PCR和WesternBlot结果显示，褪黑素诱导的雏鸡睾丸支持细胞增殖能力及增殖基因CCND1mRNA和蛋白表达水平极显著下调(P＜0.01)。
3、WesternBlot技术检测褪黑素对ERK信号通路的影响，结果显示，褪黑素显著增加了ERK磷酸化水平(P＜0.05)；随后，用20μMPD98059(ERK抑制剂)预处理2h，检测褪黑素诱导的支持细胞增殖的变化。CCK-8和EdU结果显示，与褪黑素(MT)组相比，添加PD98059使褪黑素诱导的雏鸡睾丸支持细胞活力和细胞增殖能力极显著下降(P＜0.01)；qRT-PCR和WesternBlot结果显示，阻断ERK信号通路，增殖基因PCNA和CCND1mRNA和蛋白表达量显著下降(P＜0.05)；RT-qPCR和ELISA结果显示，MT+PD98059组雏鸡睾丸支持细胞INHA表达量下调(P＜0.01)。
本研究结果表明，褪黑素可通过激活ERK信号通路上调INHA的表达，从而促进了雏鸡睾丸支持细胞的增殖。
1、油红O染色、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫荧光法结果表明，实验中分离的细胞为雏鸡睾丸支持细胞。用1、10、100、1000nM浓度褪黑素分别处理细胞48h，CCK-8、RT-qPCR和WesternBlot结果显示，雏鸡睾丸支持细胞活力、增殖基因PCNA和CCND1mRNA和蛋白表达量显著上升(P＜0.05)；EdU结果显示，雏鸡睾丸支持细胞增殖能力极显著上升(P＜0.01)；根据结果选取1000nM褪黑素处理支持细胞，用于后续实验。
2、RT-qPCR和ELISA结果显示，褪黑素可显著上调INHA的表达水平(P＜0.05)。随后，利用三条不同序列siRNA转染细胞24h，利用qRT-PCR和ELISA方法筛选出最佳干扰序列。敲减INHA基因后，CCK-8结果显示，褪黑素诱导的雏鸡睾丸支持细胞活力显著下降(P＜0.05)；EdU、qRT-PCR和WesternBlot结果显示，褪黑素诱导的雏鸡睾丸支持细胞增殖能力及增殖基因CCND1mRNA和蛋白表达水平极显著下调(P＜0.01)。
3、WesternBlot技术检测褪黑素对ERK信号通路的影响，结果显示，褪黑素显著增加了ERK磷酸化水平(P＜0.05)；随后，用20μMPD98059(ERK抑制剂)预处理2h，检测褪黑素诱导的支持细胞增殖的变化。CCK-8和EdU结果显示，与褪黑素(MT)组相比，添加PD98059使褪黑素诱导的雏鸡睾丸支持细胞活力和细胞增殖能力极显著下降(P＜0.01)；qRT-PCR和WesternBlot结果显示，阻断ERK信号通路，增殖基因PCNA和CCND1mRNA和蛋白表达量显著下降(P＜0.05)；RT-qPCR和ELISA结果显示，MT+PD98059组雏鸡睾丸支持细胞INHA表达量下调(P＜0.01)。
本研究结果表明，褪黑素可通过激活ERK信号通路上调INHA的表达，从而促进了雏鸡睾丸支持细胞的增殖。