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致病杆菌属(Xenorhabdus sp.)是肠杆菌科一类与斯氏线虫属(Steinernema sp.)互利共生的革兰氏阴性细菌,能产生大量具有杀虫、抑菌、抗肿瘤等生物活性的次级代谢产物。基于对致病杆菌HN_xs01基因组测序以及生物信息学分析,发现基因组中存在大量的隐性基因簇,而目前对致病杆菌次级代谢产物的研究缺乏有效的基因编辑方法,从而阻碍了新天然产物的发现。Red/ET同源重组技术通过短同源臂以及重组酶能够高效的促进双链断裂修复和瞬间重组,重组效率高,逐渐成为基因功能探索以及新菌株构建的有力手段。本研究旨在以Red/ET同源重组原理为基础,基于致病杆菌全基因组测序结果,应用致病杆菌自身噬菌体的重组酶在致病杆菌HN_xs01中建立和优化新型重组酶系统,以便高效快捷地进行次级代谢产物的挖掘。主要研究结果如下:(1)致病杆菌和气单胞菌重组系统的研究。通过将致病杆菌和杀鲑气单胞菌的基因组及噬菌体基因与Red/ET同源重组蛋白进行Blast比对,在致病杆菌中获得了Redα、Redβ的同源蛋白,在气单胞菌中获得了RecE、Rec T、Redγ的同源蛋白,由此构建了致病杆菌和气单胞菌重组系统表达质粒,并在大肠杆菌中进行了重组效率的验证和比较。(2)电转化方法的建立。本研究测定了致病杆菌的生长曲线,探究了最佳电转缓冲液,以及电击时电压和培养基对电转化的影响。获得了致病杆菌最佳的电转条件是:在LB培养基中30℃振荡培养4 h(OD600为0.8~1.0),制备感受态细胞时使用溶液A电转缓冲液(0.5 mol/L山梨醇、0.5 mol/L甘露醇、10%甘油)并添加蛋白酶K处理20 min,电压为1200 V,可以获得最佳的转化效率。(3)次级代谢产物的挖掘。基于同源重组双交换使HN_xs01菌株cluster1失活,通过与野生型菌株的次级代谢产物比较,借助生物分子快速纯化系统和高效液相色谱分离,结合高分辨质谱和核磁共振技术,获得16 min差异峰(M16)和19 min差异峰(M19)。鉴定M16为白色无定型粉末,其特征吸收峰λmax(MeOH)为230 nm和260nm,相对分子质量是843,化学式为C45H61N7O9,由7个氨基酸(脯氨酸1-苏氨酸2-苯丙氨酸3-脯氨酸4-脯氨酸5-亮氨酸6-缬氨酸7(phe 1-Thr 2-phe 3-Pro 4-Pro 5-Leu 6-Val 7))和1个带脂肪链的氨基酸连接形成的环脂肽类化合物。鉴定M19为黄褐色油状物,其特征吸收峰λmax(MeOH)为240 nm和274 nm,相对分子质量为148。生物活性测定发现,M16和M19对白色念珠菌和枯草芽孢杆菌均表现出一定的抑菌效果,其中M16可致使肿瘤细胞HeLa和昆虫细胞CF-203皱缩变圆,贴壁性减弱,数量减少,并以剂量依赖性方式抑制两种细胞的增殖。上述结果表明,本研究不仅为致病杆菌基因编辑和遗传操作提供了有效的方法,也为其他细菌重组系统的构建和转化提供了新思路。同时,该研究方法也丰富了次级代谢产物库,为挖掘更多具有生物活性的天然产物奠定了基础。