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油橄榄(Olea europaea L.)属于木犀科(Oleaceae),是世界上一种重要的优质木本油料树种。油橄榄果实经压榨所得的橄榄油是目前世界上公认的最为健康的食用油,具有极佳的天然保健功效与美容功效,被誉为“液体黄金”、“植物油皇后”。油橄榄中富含的黄酮是一类多酚化合物,在植物生命活动中发挥着重要的生理功能,此外还可以作为药物具有多种药理作用,因此具有十分重要的开发潜力和研究价值。黄酮类化合物是植物苯丙烷代谢途径中的次生代谢物,苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)、查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)和查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)是黄酮合成代谢途径中的三个关键酶,对植物中黄酮类物质的积累有重要的作用。本实验综合运用同源克隆、反转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)、融合引物嵌套PCR (fusion primer and nested integrated PCR, FPNI-PCR)与3’-cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA end, RACE)等分子生物学技术,分别从油橄榄中克隆到PAL、 CHS、CHI的全长DNA与cDNA,并进行了相关的生物信息学分析,三个基因分别命名为OePAL、OeCHS、 OeCHI。此外,还对克隆到的OePAL在毕赤酵母X33中进行了诱导表达,且进行了相关的酶学性质研究。得到如下主要研究结果。1. OePAL的DNA全长2970 bp,含有一个内含子(393～1220 bp),全长cDNA有2142 bp,开放阅读框编码713个氨基酸,且与其他植物有较高的同源性。氨基酸序列分析显示,OePAL属于稳定性蛋白,分子式为C3424H5490N944O1052S25,等电点为5.83,不含信号肽序列；所编码的多肽链中有4个脱氨位点(L20、V204、L25、A254)和11个催化活性位点(N257、G258、N379、D380、N381、H393、H483、N484、Q485、 D486、V487),且包含56.52%的a-螺旋、5.61%的β-转角和30.86%的无规则卷曲。利用该基因构建的重组质粒pPICZa A-OePAL成功地在毕赤酵母X33中进行了表达。SDS-PAGE检测显示该重组酶的分子量在77.5 kD左右,纯化后的比活力为196.3U/mg。酶学性质研究表明：该重组酶的最适反应条件为40℃,pH 8.8；在50℃以下,pH 7.7～9.2保温半小时酶活力可以保持相对稳定；在供试范围内Cu2+与Na+可以提高该酶活性；以L-苯丙氨酸为底物,在最适条件下该酶的Km为4.89×104 mol/L。2. OeCHS有3个外显子,且包含1个1173 bp的开放阅读框,编码390个氨基酸,其氨基酸序列与葡萄和番茄全长CHS氨基酸序列的相似性在90%左右。氨基酸序列分析显示,OeCHS的相对分子量为43.0445 kD, 分子式为C1915H3053N519O568S19,等电点为6.24,不含信号肽,属于不稳定性蛋白,活性中心由4个高度保守的氨基酸残基(C164、H303、N336、F215)构成,空间结构中有44.36%的α-螺旋、6.92%的β-转角和33.08%的无规则卷曲。3. OeCHI的全长DNA包含有4个外显子和3个内含子,全长cDNA包含有一个编码249个氨基酸多肽链的完整ORF,该ORF序列与梨和樱桃的相似度最高,但也仅为68.84%和67.81%,其编码的氨基酸序列与金银花CHI的相似度最高为65.87%。OeCHI中有4个重要的催化位点(T50、Y108、N115、S192)和7个底物结合位点(R38、G39、L40、F49、I52、K111、V112),属于细胞质中的一种不稳定性蛋白,其分子式为C1202H1890N306O368S4,相对分子量为26.64 kD,等电点为6.01,在二级结构中有42.57%的α-螺旋、8.03%的β-转角和32.53%的无规则卷曲。