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花粉通过产生雄配子并将其传递到胚囊完成双受精过程而在植物的繁衍中起着关键的作用。花粉发育步骤繁多、调控复杂,涉及众多基因的表达和调控,但目前对花粉发育的已有研究成果尚不足以全面深入认识该过程。从转录组水平对花粉发育突变体进行分析,可以筛选得到较大数量的花粉发育相关基因,并获得其在花粉发育中的动态表达特征,不仅有助于在整体水平上理解花粉发育的特征,而且可以深入认识该过程的分子调控机制,从而为农业生产中植物花粉育性的调控提供重要的理论依据。本文以遗传性状稳定的白菜(Brassica campestris L.subsp.chinensis Makino,syn.B.rapa subsp.chinensis)‘矮脚黄’核雄性不育(‘Aijiaohuang’genic male sterility,ajhGMS)两用系‘Bcajh97-01A/B’的不育花蕾和可育花蕾为材料,利用RNA测序技术获得了花粉母细胞时期、四分体时期、单核花粉时期、双核花粉时期和成熟花粉时期这五个花粉发育阶段的转录组数据。对不同发育阶段花蕾的转录组差异基因分析结合对‘Bcajh97-01A/B’花粉发育的细胞学观察,筛选到一批涉及白菜花粉发育和花粉壁形成的功能基因和转录因子。随后,对两个MYB基因BcMF28和BcMYB1R203进行序列结构、蛋白特性、时空表达等分析,进而采用人工miRNA技术或RNA干涉技术以及异源表达的手段对其进行功能验证,从形态学、细胞学、分子生物学等方面分析这两个MYB基因在花粉发育中的作用机制。取得的主要结果与结论如下:(1)细胞学观察结果显示,‘Bcajh97-01A’花粉母细胞减数分裂过程中的核分裂过程正常,但胼胝质未在内部沉积,从而无法形成孢间胼胝质壁,导致四分体无法形成。‘Bcajh97-01A’绒毡层细胞提早发生程序性死亡,引起绒毡层小体缺失和造油体发育缺陷,导致花粉外壁发育异常。(2)以‘Bcajh97-01A/B’不育花蕾和可育花蕾为材料,利用RNA测序技术获得了花粉母细胞时期、四分体时期、单核花粉时期、双核花粉时期和成熟花粉时期这五个花粉发育阶段(Ⅰ~Ⅴ)的基因表达谱。对同一花粉发育时期的‘Bcajh97-01A’和‘Bcajh97-01B’花蕾的基因表达进行比较,发现共有8,288个(11.48%)基因在至少一个时期差异表达。对差异表达基因的功能分析鉴定得到一批花粉壁发育相关基因,包括胼胝质代谢基因、花粉外壁形成基因和细胞壁修饰基因。筛选获得25个编码不同种类蛋白的候选基因可能与绒毡层的发育和功能相关。493个转录因子编码基因在不育花蕾和可育花蕾中差异表达,其中,70个基因在可育花蕾中特异表达,而18个基因在不育花蕾中特异表达。(3)通过序列比较和表达分析,发现BcMF28是花药特异的R2R3-MYB基因。序列分析表明,BcMF28编码一个R2R3-MYB蛋白,并与拟南芥R2R3-MYB第18亚组成员享有高度相似的氨基酸序列。亚细胞定位分析和转录激活检测结果表明,BcMF28定位于细胞核和细胞质中,并具有转录激活能力。利用qRT-PCR技术和启动子-GUS报告系统分析BcMF28的时空表达特点,发现BcMF28在花序中优势表达,并在双核花粉时期的可育花蕾中表达最高。启动子-GUS报告系统分析结果显示,BcMF28在发育后期花蕾的花药中特异表达,主要在绒毡层、发育中的小孢子、花药内壁和花丝中表达。(4)采用基因表达抑制技术和异源表达的方法对BcMF28的生物学功能进行鉴定,发现BcMF28参与花粉壁形成和花粉发育的调控。利用人工miRNA技术抑制BcMF28的表达后,转基因植株的花粉活力不受影响,但外壁网纹结构紊乱,外壁孔隙内的含油层堆积异常,表明BcMF28表达受抑制影响花粉壁的发育。转基因植株的绒毡层细胞在双核花粉时期分布着异常出现的脂滴状物质,花粉外壁的基粒棒排列变密集并且长度有所增加。BcMF28在其自身启动子驱动下异源表达至拟南芥后引起完全的雄性不育。形态学和细胞学观察结果表明,转基因植株的花药因隔膜和裂缝没有降解而完全不开裂,同时转基因植株的花丝变短、花粉部分败育。此外,BcMF28的表达受抑制及其异源表达均引起花粉粒变大。转基因菜心和拟南芥的表型分析表明BcMF28通过调控花粉壁的构建参与花粉发育,同时涉及花粉成熟、花丝伸长和花药开裂等过程的调控。(5)利用生物信息学分析、5’RACE实验和烟草瞬时共表达体系验证了BcMF28的表达受Bra-miR319调控。miRNA靶基因网站预测分析结果显示,拟南芥R2R3-MYB第18亚组成员对应的所有9个白菜同源基因中,BcMF28是唯一一个预测只受Bra-miR319调控的基因。5’RACE实验证明BcMF28的转录本被Bra-miR319剪切。烟草瞬时共表达实验进一步证明了Bra-miR319调控BcMF28的表达,并且白菜中不同的miR319拷贝对BcMF28表达存在不同的影响,而Bra-miR159不参与对BcMF28的表达调控。(6)203个白菜1R-MYB基因中有190个成员在根、叶片、花序和角果中表达。其中,近40%的基因(77/190)在花序中优势表达。‘Bcajh97-01A/B’花蕾转录组数据分析发现,61个白菜1R-MYB基因在各级花蕾中表达。其中,20个基因在可育花蕾和不育花蕾中差异表达。68个拟南芥1R-MYB基因中有61个成员在根、叶片、花序和角果中表达。其中,近40%的成员(24/61)在花序中优势表达。拟南芥花粉芯片表达数据以及绒毡层细胞的转录组测序数据分析发现,51个拟南芥1R-MYB基因在不同发育阶段的花粉或绒毡层中表达。综合比较白菜与拟南芥的基因表达数据,筛选得到8个花粉发育相关的候选1R-MYB基因。(7)通过基因表达和功能分析,发现一个花药特异的1R-MYB基因BcMYB1R203参与花粉发育的调控。序列分析结果表明,BcMYB1R203与其拟南芥同源基因AtMYBR57具有高度相似的核酸序列,两者均编码CPC类的1R-MYB蛋白。亚细胞定位分析和转录激活检测结果表明,BcMYB1R203和AtMYBR57均定位于细胞核和细胞质中,并都具有转录激活能力。时空表达分析结果显示,BcMYB1R203在白菜可育株系的Ⅱ级花蕾中特异表达,启动子-GUS报告系统分析结果进一步将其表达部位定位于减数分裂时期的孢母细胞、四分体和绒毡层中,AtMYBR57的时空表达与其完全一致。利用CaMV 35S启动子驱动BcMYB1R203在拟南芥中异源表达后,转基因植株近一半的花粉因内含物的降解和内壁发育异常而发生败育,表明BcMYB1R203参与花粉发育的调控。