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登革病毒(Dengue virus, DV)为有包膜的单正链RNA病毒,黄病毒属成员,以埃及伊蚊和白蚊伊蚊为媒介广泛流行于热带和亚热带国家和地区。引起人类感染的登革病毒共有4种血清型,其所致的登革热、登革出血热和登革休克综合症是严重危害人类健康的疾病。全球有25~30亿人生活在登革热流行区内,每年有1亿以上的人遭受感染,其中约100万人会发展成更为严重的登革出血热和登革休克综合症,死亡率5~20％。我国东南沿海是登革热的重点流行区域,每年都有爆发流行,且随着全球人口流动及蚊媒迁徙,登革热将越来越成为我国的公共卫生问题。目前对登革热尚未有效的防治措施,疫苗是预防和控制登革热的有效手段,以往的登革热疫苗研究主要集中在单一血清型别,效果单一;或将4种型别DV的某一肽段串联在一起,分子量大,结构呈现不完整,效果不佳;尤其是 DV存在抗体依赖的感染增强现象(Antibody-dependent enhancement, ADE),即感染一种血清型DV后,机体产生的抗体(主要是非中和抗体)在另一血清型DV感染时可导致感染增强,引起严重的出血热,故迄今尚无安全、可靠的登革疫苗上市。 课题组前期对4种型别DV的抗原进行了表位分析,以DV抗原分子之中和表位集中的包膜 E蛋白 III区为基础,采用氨基酸简并机制,设计、筛选并制备了一组抗原分子,动物实验表明能刺激机体产生高滴度(1:204800)的保护性抗体,动物保护率>95%。在此基础上获得了一条具有交叉保护功能的候选疫苗分子(DV-EDIII),经初步细胞和动物保护实验证明 DV-EDIII对不同血清型登革病毒感染有交叉保护作用,减少了 ADE发生(已申报发明专利201110300602.3),但如何选择合适的疫苗载体来呈递DV-EDIII是接下来需要思考的问题。 细菌膜泡(membrane vesicles, MVs)是以出芽方式从细菌表面分泌的球形双层膜结构,直径20-200nm不等,是细菌分泌胞外因子的重要机制之一。作为新的疫苗递送系统,不仅能将有效抗原表位呈现在膜泡表面,模拟天然病毒诱发机体的保护性免疫,同时膜泡为细菌在生长过程中自然分泌,具有稳定,高效等优势。近年来,革兰阴性菌的膜泡作为新的疫苗传递载体在预防脑膜炎、细菌性痢疾、肺结核等流行性疾病方面得到广泛关注,脑膜炎奈瑟菌膜泡疫苗的应用更证实了细菌膜泡作为疫苗载体使用的前景,虽然膜泡诱发的机体免疫保护机制尚未了解清楚,但这种免疫保护与膜泡携带传递的一种或多种抗原刺激机体产生的免疫力有关。2009年Lee等人证实革兰阳性菌也能产生细菌膜泡,如果能使用革兰阳性菌膜泡作为疫苗组分的递送系统,既可避免革兰阴性菌热原质LPS的影响,也可将外源基因插入膜泡携带主要抗原基因中,形成融合蛋白并随膜泡分泌,从而达到制备多种疫苗乃至多价疫苗的目的。本课题利用新近发现的革兰阳性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的膜泡分泌机制,通过基因重组技术将课题组前期设计合成的登革病毒保护性抗原分子 DV-EDIII插入到金黄色葡萄球菌膜泡携带蛋白中,通过金黄色葡萄球菌的膜泡分泌,制备登革热膜泡疫苗,并对其免疫效能进行研究,主要研究内容和结果如下: 1.金黄色葡萄球菌膜泡的制备及DV-EDIII融合靶蛋白分子的筛选 常规培养金黄色葡萄球菌 RN4220,对培养上清进行超滤,使体积缩小至原体积的1/6,然后超高速离心获得细菌膜泡的粗纯产物,然后通过密度梯度离心法对膜泡作进一步纯化,获得细菌膜泡。透射电镜观察,证实所制备的膜泡直径为20-200nm,圆形或椭圆形,膜泡结构。通过SDS-PAGE对制备的膜泡进行分析,发现金黄色葡萄球菌膜泡携带有多种蛋白成分,选取其中丰度较高的条带(5条),切胶进行质谱分析,筛选出膜泡携带的金黄色葡萄球菌编码的丙酮酸脱氢酶β亚单位(PdhB,分子量37kDa)作为登革病毒EDIII抗原插入的靶蛋白分子。 2.重组登革病毒EDIII膜泡产生工程菌的构建 ①金黄色葡萄球菌 RN4220-EDIII+工程菌的构建:为将登革病毒具有保护功能的简并序列DV-EDIII插入金黄色葡萄球菌PdhB的羧基端,使之与PdhB形成融合蛋白并随细菌膜泡分泌。本课题利用同源重组原理,以金黄色葡萄球菌RN4220基因组中pdhB基因的邻近序列为靶标,设计同源重组左、右臂,利用 PCR扩增获得左、右同源臂,再用 PCR从 pSET16质粒中扩增含氯霉素抗性基因的片段,从 pET22b-EDIII质粒中扩增DV-EDIII简并序列。运用重叠延伸PCR方法,获得“同源左臂-EDIII-氯霉素抗性基因-同源右臂”全长敲入片段,插入大肠埃希菌-金黄色葡萄球菌穿梭质粒pYT3,构建同源敲入质粒pYT3-EDIII。应用电转化方法将pYT3-EDIII转化金黄色葡萄球菌RN4220感受态,并根据pYT3质粒的温敏特性,筛选具有氯霉素抗性的克隆,提取基因组,采用PCR和核酸测序鉴定均表明登革病毒简并EDIII序列与金黄色葡萄球菌的pdhB基因融合正确。Western blot鉴定显示EDIII-PdhB融合蛋白不仅可以在细菌菌体中正确表达,并可通过膜泡分泌机制释放到胞外,将这种能分泌含 DV-EDIII膜泡的重组金黄色葡萄球菌命名为RN4220-EDIII+。 ②RN4220-Δagr/EDIII+工程菌的构建:在获得 RN4220-EDIII+工程菌后,利用该菌制备了细菌膜泡,在动物免疫过程中发现注射50μg/只的小鼠会死亡,表明膜泡有较强的毒力。为降低重组登革热膜泡的毒力,提高膜泡使用的安全性,我们设计并敲除了 RN4220-EDIII+工程菌中调控细菌毒力的附属调节基因agr,并观察了agr敲除后工程菌产生膜泡的毒力变化。首先以构建的RN4220-EDIII+工程菌基因组为模板,用PCR分别扩增其agr基因的上、下游约900bp片段,将上下游片段直接连接(中间不含agr编码基因)后插入穿梭质粒pYT3,构建敲除载体pYT3::Δagr,电转化RN4220-EDIII+,利用pYT3的温敏特性,筛选对四环素敏感的菌株,提取基因组, PCR验证获得 agr基因成功敲除的菌株,命名为RN4220-Δagr/EDIII+。制备RN4220-Δagr/EDIII+菌株的膜泡,按50μg/只剂量进行小鼠攻毒实验,结果显示工程菌agr基因缺失后,膜泡的毒力大大降低,为后续制备安全稳定的登革热膜泡疫苗奠定了基础。 3.重组登革病毒EDIII细菌膜泡的免疫效能研究 ①膜泡的制备:利用发酵罐培养 RN4220-Δagr/EDIII+工程菌,分离培养上清制备细菌膜泡,经 BCA法测定膜泡的蛋白总量,结果显示利用发酵罐制备的重组登革病毒EDIII细菌膜泡产量约为23mg/L。 ②膜泡免疫血清制备:采用腹腔、肌肉、皮下多点注射免疫6~8周龄Balb/c小鼠(50μg/只),免疫三次后采血,制备免疫血清,ELISA法测定血清的抗体效价。 ③膜泡免疫血清的免疫保护性:通过间接免疫荧光实验和病毒噬斑形成抑制实验检测膜泡免疫血清对vero细胞的攻毒保护作用,结果显示膜泡免疫血清在1:20~1:40时能够完全阻断登革病毒对vero细胞的感染,随着抗体稀释度升高,对 DV-2的中和能力下降,但在抗体稀释度为1:320时,仍能保护约60%的细胞免受DV-2的感染,表明重组登革病毒EDIII细菌膜泡免疫血清具有较好的保护效果。 综上所述,本文通过基因重组敲入技术将课题组前期设计、合成的对登革病毒具有保护能力的抗原表位 DV-EDIII简并序列成功融合入金黄色葡萄球菌 pdhB的3’-端终止密码前,并可随膜泡的分泌机制进行分泌表达;通过敲除登革热膜泡产生工程菌的毒力调控基因 agr,降低了膜泡的毒力,提高了重组膜泡的安全性。经小鼠免疫制备的膜泡免疫血清能够抑制登革病毒对VERO细胞的感染,具有良好的保护效果,为后续制备安全有效的登革病毒膜泡疫苗奠定了基础。