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β-葡萄糖苷酶(BGL)是纤维素酶系中的一个重要组分。β-葡萄糖苷酶可以水解纤维二糖,实现纤维素酶的彻底降解。本研究对比了黑曲霉As3.350和绿色木霉3.3744β-葡萄糖苷酶活性,结果表明黑曲霉的β-葡萄糖苷酶活(0.36563u/ml)明显高于绿色木霉该酶酶活(0.04618u/ml)。
本试验利用CTAB法、简化CTAB法、氯化苄法和快速提取法等4种方法进行黑曲霉基因组总DNA的提取,并采用琼脂糖凝胶电泳和PCR特异性扩增对DNA进行了鉴定。电泳检测结果表明4种方法均可提取到黑曲霉基因组DNA,但PCR检测结果表明只有CTAB法和简化CTAB法提取的DNA可用作bgl1基因的PCR模板。而且本试验在不影响PCR模板质量的前提下对简化CTAB法进行了优化,降低了试验的危险性。
依据GenBank已公布的黑曲霉bgl基因序列,设计合成了一对PCR引物,以黑曲霉As3.350总DNA为模板,扩增得到了大小为3.0kb的DNA片段,与pGEM-Teasy载体连接后成功转入大肠杆菌。对克隆的DNA片段进行测定,结果表明:所得目的DNA片段为2948bp,与GenBank已公布黑曲霉bgl1基因全序列进行比较,结果表明核苷酸序列同源性达到91﹪,证明该DNA片段确为黑曲霉bgl1基因(GenBank基因序列号为DQ220304)。分析发现该基因含有A639个,T688个,G841个,C780个,G+C含量为54.99﹪,在455~2261bp间序列同源性较高(最高可达97﹪)。该基因由七个外显子和六个内含子组成,六个内含子分别位于58-153bp、297-347bp、393-445bp、499-549bp、1742-1804bp、2664-2714bp处。
依据目的基因序列对七个外显子进行拼接后得到cDNA序列,利用相关分析软件分析发现cDNA大小为2583bp,其中A541个,T579个,G758个,C705个,G+C含量为56.64﹪。与GenBank已公布黑曲霉bgl1基因(AJ132386)的外显子进行比较,结果表明核苷酸序列同源性达到93.6﹪。该cDNA序列在1012~1101bp的同源性相对最高(可达100﹪),保守性最好,推测该区域可能为黑曲霉bgl1基因的主要功能区。
通过核苷酸和氨基酸序列分析可知:该基因可编码一个860个氨基酸的蛋白质-BGL1,其信号肽序列是N端前20位氨基酸残基,此蛋白质属于糖苷酶家族3,它的亲核反应的催化中心Asp-261区完全保守。