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目的:1通过疼痛行为学测定、组织形态学观察和炎症介质检测阐明右归丸加味治疗KOA大鼠膝关节疼痛的有效性。2基于TRPV4/p38 MAPK/CREB信号通路探讨右归丸加味对KOA大鼠外周敏化的作用机制。3基于缓激肽受体对p38 MAPK信号通路的调控作用探讨右归丸加味对KOA大鼠中枢敏化的作用机制。材料与方法:1右归丸加味对KOA大鼠疼痛行为、组织形态和炎症介质的影响实验选用成年健康SD大鼠64只,大鼠由辽宁长生生物科技有限公司提供,购入后于辽宁中医药大学动物实验中心饲养,适应性饲养一周后开始实验。造模前采用随机数字表法将大鼠分为假手术组14只,造模组50只。采用改良Hulth法复制KOA大鼠模型。采用HE染色法对假手术组和造模组大鼠各2只进行模型评价后,将造模组大鼠按随机数字表法分为模型组、右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组,每组12只,雌雄各半。造模成功后,右归丸合芍药甘草汤组、右归丸组和塞来昔布组分别按其生药361.8mg/kg、145.8mg/kg和1.08mg/kg溶于等体积0.9%生理盐水中,每日一次经口灌胃;假手术组和模型组大鼠予等体积0.9%生理盐水灌胃;灌胃周期均为4周。分别于第0、7、14、21和28天采用Von Frey纤维丝刺激大鼠左后足中部位检测大鼠机械性疼痛阈值（MWT）。灌胃28天结束后,观察大鼠一般状态。取材大鼠血清和滑膜组织,采用HE染色法观察KOA大鼠滑膜组织病理变化;采用ELISA法检测血清中IL-1β、TNF-α、SP、PGE2、BK含量;采用ELISA法检测滑膜组织中IL-1β、TNF-α、SP、PGE2、BK含量。2基于TRPV4/p38 MAPK/CREB信号通路探讨右归丸加味对KOA大鼠外周敏化的作用机制模型分组、模型复制和模型干预方式同前。各组随机选取6只大鼠,取材大鼠L3-L5背根神经节。采用Western Blot法检测KOA大鼠背根神经节中TRPV4、p-TRPV4、p38 MAPK、p-p38 MAPK、CREB、p-CREB表达水平;采用免疫组化法检测大鼠背根神经节中p-TRPV4、p-p38 MAPK、p-CREB表达水平。3基于缓激肽受体对p38 MAPK信号通路的调控作用探讨右归丸加味对KOA大鼠中枢敏化的作用机制模型分组、模型复制和模型干预方式同前。选取各组剩余6只大鼠,取材大鼠丘脑组织。采用ELISA法检测KOA大鼠脑组织中IL-1β、TNF-α、BK含量;采用免疫荧光法检测KOA大鼠脑组织中B1R、B2R及其共表达水平;采用Western Blot法检测KOA大鼠脑组织中p38 MAPK、p-p38 MAPK、B1R、B2R表达水平;采用免疫组化法检测大鼠脑组织中p-p38 MAPK表达水平。结果:1右归丸加味对KOA大鼠疼痛行为、组织形态和炎症介质的影响1.1大鼠一般状态观察:实验期间各组大鼠无死亡。假手术组大鼠整个实验期间状态良好,食水及二便正常,毛发洁白有光泽,体重随饲养进行明显增长,膝关节活动正常,行动自如。模型组大鼠状态逐渐低迷,情绪易激动,毛发枯槁变黄,行动呈跛行,左侧膝关节肿胀变形严重。右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组大鼠上述表现较模型组大鼠有不同程度改善。1.2 Von Frey纤维丝检测各组大鼠MWT变化:28天内,假手术组MWT变化不明显,模型组呈现下降趋势,右归丸加味组较右归丸组和塞来昔布组提高;右归丸加味组和塞来昔布组在第1-7天时间段内提高速度相近,且提高速度均大于右归丸组;右归丸加味组在第8-14天时间段内提高速度最快;右归丸组和塞来昔布组在第22-28天时间段内提高速度最快。第1天灌胃给药开始前测量,各组MWT比较差异无统计学意义（P＞0.05）。给药第28天,右归丸加味组较假手术组MWT显著升高（P＜0.01）,差异有统计学意义;模型组与假手术组比较差异无统计学意义（P＞0.05）;右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组较模型组MWT显著升高（P＜0.05或P＜0.01）,差异有统计学意义;右归丸加味组较右归丸组MWT显著升高（P＜0.05）,差异有统计学意义;右归丸加味组和塞来昔布组比较无统计学意义（P＞0.05）。1.3各组大鼠膝关节滑膜组织HE染色结果显示:假手术组大鼠滑膜组织正常,细胞扁平、排列整齐,无充血水肿、炎性细胞浸润和新生血管。模型组大鼠滑膜组织可见大量炎性细胞浸润和新生血管,滑膜细胞增生、排列紊乱。右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组可见少量炎性细胞浸润和新生血管,滑膜细胞轻度增生、排列轻度紊乱,右归丸加味组优于右归丸组和塞来昔布组。1.4 ELISA法检测各组大鼠血清中IL-1β、TNF-α、SP、PGE2、BK含量结果显示:与假手术组比较,模型组、右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组IL-1β、TNF-α、SP、PGE2、BK含量均有显著升高（P＜0.05或P＜0.01）,差异有统计学意义;与模型组比较,右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组IL-1β、TNF-α、SP、PGE2、BK含量均有显著降低（P＜0.01）,差异有统计学意义;右归丸加味组与右归丸组和塞来昔布组比较,IL-1β、TNF-α、SP、PGE2、BK含量均有显著降低（P＜0.01）,差异有统计学意义。1.5 ELISA法检测各组大鼠滑膜组织中IL-1β、TNF-α、SP、PGE2、BK含量结果显示:与假手术组比较,模型组、右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组IL-1β、TNF-α、SP、PGE2、BK含量均有显著升高（P＜0.05或P＜0.01）,差异有统计学意义;与模型组比较,右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组IL-1β、TNF-α、SP、PGE2、BK含量均有显著降低（P＜0.01）,差异有统计学意义;右归丸加味组分别与右归丸组和塞来昔布组比较,IL-1β、TNF-α、SP、PGE2、BK含量均有显著降低（P＜0.01）,差异有统计学意义。2基于TRPV4/p38 MAPK/CREB信号通路探讨右归丸加味对KOA大鼠外周敏化的作用机制2.1 Western Blot法检测各组大鼠背根神经节中TRPV4、p-TRPV4、p38 MAPK、p-p38MAPK、CREB、p-CREB蛋白表达结果显示:各组大鼠背根神经节中TRPV4、p38 MAPK、CREB组间比较,差异无统计学意义（P＞0.05）;与假手术组比较,模型组、右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组p-TRPV4、p-p38 MAPK、p-CREB表达水平显著升高（P＜0.01）,差异有统计学意义;与模型组比较,右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组p-TRPV4、p-p38 MAPK、p-CREB表达水平显著减低（P＜0.01）,差异有统计学意义;右归丸加味组与右归丸组比较,p-TRPV4、p-p38 MAPK、p-CREB表达水平显著减低（P＜0.01）,差异有统计学意义;右归丸加味组与塞来昔布组比较,p-TRPV4和p-p38 MAPK表达水平显著降低（P＜0.01）,差异有统计学意义,但p-CREB表达水平差别不大（P＞0.05）,无统计学意义。p-TRPV4/TRPV4、p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-CREB/CREB的各组间比较结果与上述各磷酸化蛋白组间比较结果完全相同。2.2免疫组化法检测各组大鼠背根神经节中p-TRPV4、p-p38 MAPK、p-CREB蛋白表达水平结果显示:与假手术组比较,其余各组大鼠背根神经节中p-TRPV4、p-p38 MAPK、p-CREB蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）,差异有统计学意义;与模型组比较,右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组p-TRPV4、p-p38 MAPK、p-CREB蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）,差异有统计学意义;右归丸加味组与右归丸组比较,右归丸加味组中p-TRPV4、p-p38 MAPK和p-CREB显著降低（P＜0.05或P＜0.01）,差异有统计学意义;右归丸加味组与塞来昔布组比较,右归丸加味组中p-p38 MAPK和p-CREB显著降低（P＜0.01）,差异有统计学意义,而p-TRPV4差别不明显（P＞0.05）,差异无统计学意义。3基于缓激肽受体对p38 MAPK信号通路的调控作用探讨右归丸加味对KOA大鼠中枢敏化的作用机制3.1 ELISA法检测各组大鼠脑组织中IL-1β、TNF-α、BK含量结果显示:与假手术组比较,模型组、右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组IL-1β、TNF-α、BK含量均有显著升高（P＜0.01）,差异有统计学意义;与模型组比较,右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组IL-1β、TNF-α、BK含量均有显著降低（P＜0.01）,差异有统计学意义。右归丸加味组与右归丸组和塞来昔布组比较,IL-1β、TNF-α、BK含量显著降低（P＜0.01）,差异有统计学意义。3.2免疫荧光法检测各组大鼠脑组织中B1R、B2R及其共表达水平,计算阳性细胞数,结果显示:与假手术组比较,模型组、右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组B1R、B2R及B1R和B2R共表达阳性细胞数均有显著增多（P＜0.01）,差异有统计学意义;与模型组比较,右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组B1R、B2R及B1R和B2R共表达阳性细胞数均有显著减少（P＜0.01）,差异有统计学意义。右归丸加味组分别与右归丸组和塞来昔布组比较,B1R、B2R和B1R与B2R共表达阳性细胞数显著减少（P＜0.05或P＜0.01）,差异有统计学意义。3.3 KOA大鼠脑组织中p38 MAPK、p-p38 MAPK、B1R、B2R表达水平3.3.1 Western Blot法检测各组大鼠脑组织中p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表达水平,结果显示:各组大鼠脑组织中p38 MAPK组间比较,差异无统计学意义（P＞0.05）;与假手术组比较,模型组、右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组p-p38 MAPK表达水平显著升高（P＜0.01）,差异有统计学意义;与模型组比较,右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组p-p38 MAPK表达水平显著减低（P＜0.01）,差异有统计学意义;右归丸加味组分别与右归丸组和塞来昔布组比较,p-p38 MAPK表达水平显著减低（P＜0.01）,差异有统计学意义。p-p38 MAPK/p38 MAPK各组间比较结果与p-p38 MAPK完全一致。3.3.2 Western Blot法检测各组大鼠脑组织中B1R、B2R蛋白表达水平,结果显示:与假手术组比较,模型组、右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组B1R、B2R表达水平显著升高（P＜0.01）,差异有统计学意义;与模型组比较,右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组B1R、B2R表达水平显著减低（P＜0.01）,差异有统计学意义;右归丸加味组与右归丸组和塞来昔布组比较,B1R和B2R表达水平显著减低（P＜0.05或P＜0.01）,差异有统计学意义。3.3.3免疫组化法检测各组大鼠脑组织中p-p38 MAPK蛋白表达水平,结果显示:与假手术组比较,模型组、右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组p-p38 MAPK表达水平显著升高（P＜0.01）,差异有统计学意义;与模型组比较,右归丸加味组、右归丸组和塞来昔布组p-p38 MAPK表达水平显著减低（P＜0.01）,差异有统计学意义;右归丸加味组与右归丸组和塞来昔布组比较,p-p38 MAPK表达水平显著减低（P＜0.05或P＜0.01）,差异有统计学意义。结论:1右归丸合芍药甘草汤可以改善KOA大鼠一般状态,降低KOA大鼠机械性疼痛阈值,改善KOA大鼠滑膜组织病理形态,抑制KOA大鼠血清和滑膜组织中IL-1β、TNF-α、SP、PGE2、BK的表达和脑组织中IL-1β、TNF-α、BK的表达,减轻炎症反应,改善KOA大鼠膝关节疼痛症状。右归丸合芍药甘草汤治疗KOA大鼠膝关节疼痛有效。2右归丸合芍药甘草汤可能通过抑制大鼠背根神经节中TRPV4/p38 MAPK/CREB信号通路过度活化的方式调控KOA外周敏化过程。3右归丸合芍药甘草汤可能通过下调大鼠脑组织中缓激肽受体B1R和B2R的表达抑制p38 MAPK信号通路过度活化的方式调控KOA中枢敏化过程。4 p38 MAPK信号通路参与了KOA大鼠痛觉敏化,右归丸合芍药甘草汤可能通过抑制p38 MAPK信号通路过度活化的方式调控痛觉敏化过程,减轻KOA疼痛症状。