细胞内的氧化还原平衡是维持细胞稳态的关键,调控生物体的新陈代谢、发育过程以及应激反应,与疾病的发生发展密切相关。细胞内的氧化还原平衡是由不同细胞区域的多个信号分子的动态变化协同调节的。具体来说,氧化还原相关生物活性分子如活性氧（ROS）和氧化还原敏感蛋白共同调控氧化还原状态的时空变化。过量的ROS会促进氧化应激,导致炎症、癌症和肝脏缺血再灌注损伤（IRI）等疾病的发生。其中超氧阴离子(O2·-)作为最早生成的ROS,其浓度异常可触发凋亡和坏死通路,是细胞内氧化应激的典型标志物。同时,在氧化应激信号通路中,Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）通过在细胞质与细胞核之间的空间易位调节细胞的氧化还原状态。因此,同时时空分析O2·-水平和Keap1易位对深入解析氧化应激过程,阐明致病机制至关重要。蛋白质的表达水平以及亚细胞空间分布变化同时调控肿瘤的发生发展,是肿瘤潜在的生物标志物。其中,视黄酸受体（RARG）的异常表达水平与亚细胞空间分布,可能促进肿瘤细胞增殖。由此可推断,RARG的时空变化可作为肿瘤细胞检测与诊断的疾病标志物。但RARG在肿瘤细胞中易位的实时分析以及相关的致病机制尚不清楚。因此,时空分析肿瘤细胞中RARG的含量及亚细胞水平易位将有助于肿瘤的诊断和致病机制的分析。目前,荧光成像技术具有操作简单、时空分辨率高和非侵入性的优势,能够跨尺度实现从细胞到活体水平原位、实时、高分辨、无损可视化分析。目前,在国内外的研究中已经开发了许多分别用于检测ROS和蛋白质的荧光探针,但对于信号通路中不同细胞区域的多个信号分子的动态变化同时探究仍然缺乏相应工具。因此,本论文开发了能够同时检测O2·-水平和Keap1空间位置的小分子荧光探针,以及用于在细胞内检测RARG的小分子荧光探针,建立了ROS-蛋白质协同研究的方法,并以此探究了生物活性分子的时空变化在疾病中的作用机制。1、设计合成了用于同时成像检测O2·-水平和Keap1位置的荧光探针CPR-SK。该探针利用咖啡酸与O2·-的特异性识别反应以及四肽序列对Keap1的特异性靶向,同时实现了对Keap1蛋白精确定位和对O2·-的特异性识别。该探针具有高灵敏度、高特异性以及动态可逆性等优点。利用该探针,成功实现了对氧化应激引起的典型疾病IRI过程中两个生物标志物(O2·-和Keap1)的原位时空成像。进一步结果表明CPR-SK能够通过时空分析O2·-水平和Keap1易位揭示IRI的程度。该工作提出了一种时空成像分析细胞内氧化还原状态动态变化的新方法,为阐明氧化应激相关疾病的分子机制提供了新材料。2、设计合成了用于检测RARG的小分子荧光探针TC。TC以四苯乙烯为荧光团,同时引入小分子CD437作为RARG的靶向基团。靶向基团与RARG特异性结合后,促使探针TC锚定在蛋白口袋中,继而限制TC中四苯乙烯基团的旋转,导致TC激发态非辐射能量散失降低,荧光开启,从而实现了对RARG的荧光检测。细胞成像结果表明,该探针能够对RARG进行实时、原位成像。