背景感音神经性耳聋是导致言语交流障碍的一种常见疾病，严重影响患者的生活质量。尽管目前临床上治疗感音神经性耳聋的策略有很多，但治疗效果不佳。明确耳蜗细胞损伤的分子调控网络，寻找有效防治耳聋的目的基因，阻止诱导毛细胞凋亡的信号分子，成为未来耳聋基因治疗新的方向。本研究团队首次发现Nob1在哺乳动物受损耳蜗细胞中高表达，但这一表达变化的具体规律、机制及在感音神经聋中所起的作用还不清楚。目的本研究主要探寻Nob1在出生后大鼠耳蜗内的表达规律，拟利用基因转染技术改变Nob1在耳蜗毛细胞中的表达，借助体内外实验研究Nob1对耳蜗毛细胞生物学行为的影响及与耳蜗毛细胞损伤之间的关系，以期证明Nob1基因是一个新的候选耳聋基因，为深入理解耳蜗毛细胞损伤的分子事件，探讨新的治疗方法奠定基础。方法通过免疫组织荧光技术、Weatern-blot及实时定量PCR技术，观察Nob1在出生后大鼠耳蜗内的表达规律。构建含Nob1基因的慢病毒干扰载体（Nob1-RNAi-GFP-LV）以及腺病毒过表达载体（Ad5-Nob1-mCMV-EGFP），将病毒载体转染至体外培养的HK-2细胞系，上调以及下调Nob1基因表达，探寻Nob1与凋亡之间的关系。在体外行离体耳蜗器官培养，利用顺铂诱导离体耳蜗毛细胞损伤后，观察Nob1在毛细胞中的表达情况，并转染慢病毒干扰载体（Nob1-RNAi-GFP-LV），用RT-PCR和Westernblot鉴定病毒的转染及Nob1表达情况。最后在大鼠体内进一步验证Nob1在耳蜗毛细胞损伤中的作用，从耳蜗中阶入路分别将Nob1-RNAi-GFP-LV干扰载体、慢病毒空载体和人工内淋巴液注射入三组大鼠耳蜗，待RNAi发挥作用后，利用顺铂诱导大鼠耳蜗损伤，分别用ABR评估各组病毒载体注射前后大鼠听力变化；通过基底膜铺片观察毛细胞的形态变化，并采用全耳蜗毛细胞定量分析系统行耳蜗毛细胞计数，Western-blot及实时定量PCR方法进一步明确相关分子的表达变化。结果Nob1在大鼠耳蜗毛细胞及螺旋神经元中有表达，在细胞发育增殖分化高峰期比较弱，出生后随着时间的增加而逐渐增强。当毛细胞分化，内外毛细胞形成，大、小上皮嵴开始分化形成各种支持细胞时，Nob1表达较新生时期明显增强。我们成功构建含Nob1基因的慢病毒干扰载体（Nob1-RNAi-GFP-LV）以及腺病毒过表达载体（Ad5-Nob1-mCMV-EGFP），在体外培养HK-2细胞系中成功上调及下调Nob1基因，通过流式细胞仪检测到上调Nob1表达后的凋亡细胞数明显高于下调Nob1基因表达组。在体外培养的耳蜗器官组织中，通过低浓度顺铂成功诱导耳蜗毛细胞凋亡，发现Nob1在部分细胞核固缩的凋亡毛细胞细胞核中表达，出现核转位现象。随着顺铂作用时间的增加，毛细胞的损伤逐渐加重，Nob1表达也逐渐增高，Western-blot结果与免疫组织荧光结果一致。在体外培养的耳蜗器官组织中，慢病毒干扰载体无法转染至耳蜗毛细胞，只能转染至螺旋神经元。通过耳蜗中阶注射，将慢病毒干扰载体成功转染至耳蜗外毛细胞、血管纹边缘细胞及螺旋韧带处。外淋巴内可见少量慢病毒颗粒分布，而内毛细胞处及螺旋神经元处未见病毒分布。最后，在体内慢病毒干扰可下调Nob1基因表达，再给予顺铂诱导耳蜗毛细胞损伤后，与对照组相比，下调Nob1基因组的大鼠耳蜗听力阈值降低，耳蜗毛细胞损伤程度也降低。结论Nob1可能通过凋亡信号分子通路参与了耳蜗器官的形成，在顺铂诱导的耳蜗毛细胞损伤中，Nob1可能参与了耳蜗毛细胞的凋亡过程。抑制Nob1基因后可以通过凋亡信号通路，降低顺铂所诱导的大鼠听力损伤，从而减少耳蜗毛细胞的破坏。