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磷脂酶A2(PLA2)是一类能水解甘油磷脂第二位酯键生成游离脂肪酸和溶血磷脂的酶类。PLA2在植物油脱胶精炼中具有重要应用。目前,在工业上常用的脱胶酶是诺维信公司的Lecitase®Novo及Lecitase®Ultra,成本较高。本文用毕赤酵母表达系统来实现紫红色链霉菌(Streptomyces violaceoruber)来源的磷脂酶A2基因的高表达,测定了其酶学性质,根据性质特点,进行了植物油脱胶研究,为该酶的工业生产及应用奠定了良好的基础。主要研究结果包括:(1)将S.violaceoruber来源的PLA2基因(Gen Bank NO.AY359866.1)经过密码子优化后构建毕赤酵母分泌型表达重组质粒p PIC9K-PLA2,将质粒线性化后电转化巴斯德毕赤酵母,鉴定阳性菌株基因组中PLA2基因的拷贝数,分别为16、13、12、9、7、6、2、1。研究了基因拷贝数对毕赤酵母表达重组磷脂酶A2(r PLA2)的影响,结果表明r PLA2的表达量和酶活力都随拷贝数的增大而增大,但与拷贝数不成线性关系。(2)毕赤酵母表达的r PLA2蛋白在SDS-PAGE图中显示3条主要条带,分子量分别为14.3 k Da、18.2 k Da和21.0 k Da。分别用PAS法和糖苷酶Endo H内切酶法进行糖基化验证,分子量为14.3 k Da的酶蛋白未发生N-糖基化修饰,分子量为18.2 k Da和21.0k Da的酶蛋白都发生了N-糖基化修饰。(3)通过定点突变将r PLA2氨基酸序列中三个潜在N-糖基化位点N-34、N-85、N-113突变为Q,研究N-糖基化修饰对r PLA2分泌表达的影响。分析结果表明,N-85位点未发生N-糖基化修饰,N-34和N-113位点均发生N-糖基化修饰。分子量为14.3 k Da的酶蛋白没有被发生N-糖基化修饰,分子量为18.2 k Da的蛋白在N-34或N-113位发生了N-糖基化修饰,分子量为21.0 k Da的蛋白在N-34和N-113位同时发生了N-糖基化修饰。同时还考察了N-糖基化修饰对r PLA2在毕赤酵母基因工程菌中分泌表达的影响,结果表明N-糖基化位点突变对表达重组酶的胞外总蛋白浓度影响不大。N-34和N-113位点突变对发酵酶活具有促进作用,而未被N-糖基化修饰的酶蛋白r PLA2w的发酵酶活最低。(4)测定了重组r PLA2的酶学性质。r PLA2的最适温度为50°C。在42–62°C能保持70%以上的活力。r PLA2随着温度的升高,稳定性逐渐下降,温度低于33°C时,可保持70%以上。r PLA2的最适p H为6.0,在p H 6.0时稳定性最好,满足植物油脱胶的条件要求(p H 4–6),因此在植物油脱胶中有良好的应用前景。在p H 5.5–6.5范围内可以保持80%以上的酶活性,说明p H对r PLA2活力的影响较为显著。r PLA2的等电点是5.87,Ca2+可以显著提高酶的活力。(5)将r PLA2用于菜籽油的脱胶研究,通过对脱胶条件的优化,得到酶法脱胶的最佳条件为:温度40°C、p H 6.0、加水量4%、酶用量0.6 U?g-1。在此条件下,脱胶油中磷含量降低到9.6 mg?kg-1,可满足后续精炼的要求。