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猪传染性胃肠炎(Porcine transmissible gastroenteritis,TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)引起的一类猪高度传染性疾病,尤其是冬季和早春寒冷季节,呈地方性暴发流行,临床症状主要以严重腹泻、呕吐及脱水为特征,不同年龄及品种的猪均可感染,尤其是2周龄以内哺乳仔猪,死亡率达100%。TGEV灭活和减毒活疫苗在亚洲已广泛应用于生产,但近年来在已免疫疫苗的猪场仍有致病性TGEV暴发流行,因此有必要研制有效的疫苗及开展病毒致病机制相关研究。病毒-宿主相互作用的研究可鉴定出致病基因,通过修饰或缺失致病基因来减弱病毒的毒力,有助于候选疫苗和抗病毒药物的研制以防控TGEV的感染。膜蛋白(M)是TGEV重要结构蛋白,主要包埋在病毒脂质囊膜中,是病毒装配期间构成冠状病毒颗粒的重要组成部分。同时,M蛋白高度保守,其在TGEV的致病性和病毒复制及转录过程中也发挥重要作用。M蛋白与S、N及E蛋白在内质网-高尔基中间体相互作用,促进病毒粒子的装配和出芽。M-M蛋白相互作用形成同源低聚体,是冠状病毒囊膜形成的基础,膜结合同样需要高效的M-M相互作用。但M蛋白与宿主蛋白的相互作用及其对TGEV感染的调控过程仍未知。为此本研究以TGEV M蛋白为研究对象,采用酵母双杂交系统筛选宿主细胞猪小肠上皮细胞(pIECs)与M蛋白互作的宿主蛋白;GST pull-down技术验证候选蛋白与M蛋白的互作。主要研究内容如下:(1)猪小肠上皮细胞(p IECs)cDNA文库的构建及鉴定提取p IECs的细胞总RNA,SMART法反转录合成cDNA,去除短片段后定与酵母文库表达载体pGADT7共转化至酵母菌株Y187,成功构建酵母双杂交cDNA文库。对文库质量进行检测,酵母文库滴度为5.0×107 cfu/m L,插入片段在500-2000 bp。结果表明,本试验成功构建了p IECs酵母双杂交cDNA文库,且文库质量较高,可用于M蛋白互作蛋白的筛选。(2)TGEV M蛋白诱饵质粒的构建及鉴定以本实验室构建并保存的质粒pFastBacTMDUAL-M为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增M基因全长序列,然后定向克隆至酵母诱饵表达载体pGBKT7,转化至酵母菌株Y2HGold感受态细胞。对构建的诱饵载体pGBKT7-M进行细胞毒性、自转录激活活性及其在酵母细胞内的表达情况的检测。结果表明,空载体pGBKT7和诱饵载体pGBKT7-M的菌落大小和数量基本一致,构建的诱饵载体无细胞毒性;诱饵载体pGBKT7-M在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA营养缺陷培养基上没有菌落生长,说明无自激活活性;Western blot结果可见蛋白条带约为50 kDa的融合蛋白,说明诱饵载体在酵母细胞Y2HGold中正确表达。构建的诱饵载体pGBKT7-M可用于p IECs酵母双杂交cDNA文库互作蛋白的筛选。(3)酵母双杂交筛选与M蛋白相互作用的蛋白根据Clontech公司Matchmaker?Gold Yeast Two-Hybrid System操作手册,以TGEV M基因构建酵母诱饵质粒pGBKT7-M,与p IECs酵母双杂交c DNA文库进行双杂交筛选,SD/-Trp/-Leu/-Ade、SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His、SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA营养缺陷培养基上三轮筛选,并对筛选出的蛋白进行Blast分析。最终筛选获得7种可能与M蛋白互作的宿主蛋白。其中,EIF4A2蛋白的重复性较高,且根据现有文献表明,EIF4A2参与促进病毒增殖及病毒蛋白合成。因此EIF4A2将作为候选蛋白进行下一步研究及验证。(4)GST pull-down实验验证M蛋白与候选蛋白的相互作用本部分利用GST pull-down实验验证M蛋白与候选蛋白EIF4A2的相互作用。构建原核表达载体pGEX-4T-M融合表达GST-M蛋白,Glutathione Sepharose 4B琼脂糖珠进行纯化;将EIF4A2基因片段连接到原核表达载体pET-28a构建重组表达载体pET-EIF4A2,Ni亲和层析柱对融合蛋白进行纯化。然后将GST-M融合蛋白作为诱饵蛋白固化在谷胱甘肽亲和树脂上,再用纯化后的His-EIF4A2蛋白溶液过柱,通过蛋白间的互作捕获候选蛋白,反复洗脱后经SDS-PAGE,Western blot检测M蛋白与候选蛋白EIF4A2间的互作。结果表明,M蛋白与候选蛋白EIF4A2确实存在特异性的相互作用。