[目的]优化酵母表达条件，研究家蝇抗菌肽基因Attacin在酵母真核表达系统的表达情况，并对表达产物的体外抗菌活性进行初步研究。试图摸索出一套稳定、高效的真核表达系统，为规模制备家蝇抗菌肽打下基础。 [方法]①根据Genbank公布的家蝇成虫Attacin全长cDNA基因序列和本实验室构建的pcDNA3.1(+)-Attacin质粒的测序结果，利用PrimerPremier5.0和DNAclub生物学软件设计两对特异性引物，以pcDNA3.1(+)-Attacin为模板，PCR扩增出Attacin成熟肽的编码区序列，将目的片段分别克隆入pMD18-T载体，测序，并运用相关生物信息学软件对克隆的序列进行预测分析。②采用基因重组技术从重组质粒pMD18-T-Attacin中扩增出Attacin成熟肽的基因片段，将其克隆入质粒pPIC9K中，构建重组质粒pPIC9K-Attacin。 ③将重组质粒pPIC9K-Attacin线性化后，用氯化锂法转化至毕赤酵母宿主菌GS115中，筛选得到G418高耐受性多拷贝阳性表达菌株GS115/pPIC9K-Attacin。④工程菌经甲醇诱导后，采用甲醇氯仿法对发酵上清进行浓缩，取浓缩上清液进行SDS-PAGE电泳分析。 ⑤优化表达条件。 ⑥用琼脂糖平板孔穴扩散法，测定分泌上清液对大肠杆菌标准株(Ecoli)(ATCC25922)体外抑菌活性。 [结果]①以本实验室保存的pcDNA3.1(+)-Attacin质粒为模板，经PCR扩增编码Attacin成熟肽的开放阅读框DNA序列，PCR扩增得到约580bp的Attacin目的DNA片段，将其克隆至pMD18-T载体进行序列测定，测序结果正确。生物信息学分析序列，结果表明与其它昆虫的Attacin序列同源性比较，其一致性达90％～95％。 ②扩增pMD18-T-Attacin质粒，用NotI/EcoRI从重组载体pMD18-T-Attacin切下含Attacin基因的DNA片断，与经相同双酶切的真核载体pPIC9K进行重组，经双酶切和DNA序列分析，获得重组表达载体pPIC9K-Attacin。 ③将线性化重组质粒pPIC9K-Attacin用氯化锂法转染感受态酵母宿主细胞。酵母菌落法鉴定，表明实验成功地将重组质粒pPIC9K-Attacin整合入酵母基因组。鉴定转化子表型为His+Mut+，高浓度G418耐受筛选试验，发现少数转化子能够在含4mg/mlG418的抗性平板上生长，选择得到的高耐受阳性菌株进行甲醇诱导表达。 ④工程菌经0.5％甲醇诱导后，其发酵上清中含有重组表达的Attacin蛋白，SDS-PAGE证实其分子量为20Da，与预期分子量相同。 ⑤从发酵时间、诱导甲醇浓度、培养基pH值、诱导温度四方面对诱导条件进行优化。 ⑥琼脂糖平板孔穴扩散法测定发酵上清的抗菌活性，结果显示其对大肠杆菌的生长有抑制作用。 [结论]家蝇抗菌肽基因Attacin在毕赤酵母菌GS115中得到了成功表达，表达形式为分泌型，其中：诱导温度28℃，甲醇浓度为0.5％，培养基pH5.0时表达条件最佳，在第96h目的蛋白表达量最高，然后表达量下降，在诱导甲醇中加入0.5％的PMSF(蛋白酶抑制剂)有助于提高表达量。表达产物活性实验结果表明：表达产物对大肠杆菌具有一定的抑制作用。本实验为通过酵母表达系统规模制备家蝇抗菌肽打下了一定基础。