论文部分内容阅读
苯丙素类化合物是存在于植物体内的含量很低的多酚类化合物。苯丙素类化合物因其结构的独特性，使其在抗氧化、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗过敏以及抑制肥胖、调节免疫、调节心血管与内分泌等方面具有良好的生物活性，也因此在医药和食品方面具有广泛的应用。由于这类物质分子结构较复杂导致运用化学的方法进行合成非常的困难，因此用微生物为载体合成苯丙素类化合物越来越受人们重视。然而用微生物合成苯丙素类化合物有很多瓶颈，其中一点就是微生物对苯丙素类化合物的转运机制目前仍然不是非常的清楚，而转运对于提高次级代谢产物的产量具有非常重要的作用。Escherichia coli是目前研究较为透彻的原核模式菌株，并经常作为苯丙素类化合物微生物生产的宿主菌株。本文以E. coli BL21(DE3)为对象，探索了与苯丙素类化合物转运或者耐受相关的膜蛋白，并进行了分子生物学验证。本实验首先通过探索E. coli BL21(DE3)膜蛋白质组在苯丙素类化合物胁迫下的变化情况，共发现共有16个膜蛋白的表达量发生了显著的变化。其中OmpA、OmpF、OmpW、FadL、OppD、PotG、AtpD和AtpH共8个蛋白的表达量上调了2倍及以上，TolC、LamB、MalK、MalE、ManX、YaeT、YgaU和OppA共8个蛋白的表达量下调了2倍及以上。通过软件分析发现这些蛋白分布于大肠杆菌的三层膜上并且在功能上联系紧密。为了验证蛋白质组学结果的正确性，本实验通过qPCR技术验证了其中14个(AtpD和AtpH除外)蛋白的mRNA水平，其中13个mRNA与双向电泳分析得到的蛋白差异水平基本一致，而TolC的mRNA含量与蛋白质正好相反，说明TolC蛋白表达的调控机制是翻译后调控而不是转录水平的调控。为了进一步验证这些蛋白的功能，我们分别构建了14个蛋白的过量表达菌株和基因沉默菌株。我们测定了这些工程菌分别在三种苯丙素类化合物(芦丁、柚皮素和白藜芦醇)胁迫条件下的生长曲线。过量表达ompA和fadL基因以及沉默lamB、malK、malE、manX和ygaU基因会使工程菌在芦丁胁迫下的最大比生长速率分别从0.24h-1恢复到了0.43h-1、0.49h-1、0.50h-1、0.40h-1、0.39h-1、0.39h-1和0.40h-1，在柚皮素胁迫下最大比生长速率从0.21h-1分别恢复到了0.47h-1、0.49h-1、0.41h-1、0.42h-1、0.42h-1、0.37h-1和0.39h-1，在白藜芦醇胁迫下最大比生长速率从0.13h-1分别恢复到0.33h-1、0.35h-1、0.31h-1、0.30h-1、0.28h-1、0.29h-1和0.30h-1。对这些生物学过程进行分析，得出一些推论：(1)外膜蛋白OmpA和FadL可能在大肠杆菌跨膜运输苯丙素类化合物的过程中发挥了重要的作用；(2) LamB、MalK、MalE和ManX可能参与了大肠杆菌对苯丙素类化合物的吸收；(3) YgaU对于提高大肠杆菌对苯丙素类化合物的耐受性的作用仍有待进一步的研究。这些结果可能有助于增强微生物对苯丙素类化合物的生产能力。