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酒精性肝病(ALD)是世界范围内肝脏损伤的主要原因之一。肝损害发生在酒精性肝病的各个阶段,主要包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌。众所周知,肝脏是酒精代谢的主要场所,过量饮酒引起的肝脏负担是酒精性肝损伤的主要原因。酒精最先引起肝脏巨噬细胞参与的免疫反应,即肝脏炎症反应。而在肝脏代谢酒精的过程中,过量酒精引起的肝细胞凋亡也是酒精性肝损伤的重要原因。然而,饮酒对肝脏的损害及其机制尚不完全清楚。血管生成素样蛋白( ANGPTL)是近年来发现的一种新型分泌性蛋白,其家族成员ANGPTL2、ANGPTL4和ANGPTL7与炎症息息相关。ANGPTL3也是ANGPTLs成员之一,它是由肝脏合成并分泌的一种肝脏高特异性蛋白。在这项研究中,我们发现ANGPTL3在酒精性肝损伤小鼠的血清和肝脏巨噬细胞中均呈高表达。而ANGPTL3与酒精性肝损伤的关系尚不明确,是否参与了酒精性引起的炎症反应和是否参与调解肝细胞凋亡需要进一步的实验探索。
为进一步探究ANGPTL3在酒精性肝损伤中的作用。本研究采用C57BL/6J小鼠、RAW264.7细胞株、AML-12细胞株作为研究对象,经体内体外实验观察ANGPTL3对酒精性肝损伤中肝脏巨噬细胞及肝细胞的作用。本课题主要研究内容包含以下五个部分:
1.酒精性肝损伤小鼠模型的建立及ANGPTL3在小鼠肝脏及血清中的表达
本研究首先通过小鼠肝脏切片的HE染色结果判断造模成功,然后采用原位灌流的方法分别分离出小鼠肝脏肝细胞、肝星状细胞、肝脏巨噬细胞,并选用western blot检测ANGPTL3在蛋白水平上的表达及选用real-time PCR检测ANGPTL3的mRNA水平,同时通过肝脏的免疫组化及小鼠血清ELISA检测ANGPTL3在肝脏及血清中的表达。发现ANGPTL3在酒精性肝损伤肝脏及血清中呈现高表达,其表达在小鼠肝脏肝星状细胞中无表达,小鼠肝脏肝细胞中的变化不明显,而在小鼠肝脏巨噬细胞中蛋白及mRNA水平均明显上调。
2. ANGPTL3在RAW264.7细胞株、AML-12细胞株及HSCs中的表达
本研究首先采用CCK-8方法摸索了酒精对RAW264.7细胞和AML-12细胞的最适浓度,通过western blot方法发现在最适浓度酒精的刺激下ANGPTL3的表达在AML-12细胞中几乎没有变化,在RAW264.7细胞中的表达显著升高,且real-time PCR结果显示在酒精和LPS共同刺激之下升高的最明显,而ANGPTL3在HSC-LX2和HSC-T6中均无表达。另外,通过免疫荧光的方法发现ANGPTL3在酒精和LPS刺激的RAW264.7细胞中呈现高表达。
以上结果显示体外验证的结果与体内验证一致,说明在酒精性肝损伤中, ANGPTL3的升高主要是肝脏巨噬细胞中ANGPTL3表达升高所致。
3.体内验证ANGPTL3在酒精性肝损伤中的作用
通过尾静脉注射AAV8-m-ANGPTL3 shRNA-GFP对小鼠肝脏ANGPTL3进行敲低并注射AAV8-GFP(NC group)作为对照组。高斌法酒精性肝损伤模型建立后,通过对肝脏组织的冰冻切片验证病毒感染成功,通过小鼠体重变化及肝重比体重验证造模成功,通过ELISA检测了小鼠血清及肝脏中ANGPTL3水平验证尾静脉注射AAV8-m-ANGPTL3 shRNA-GFP敲低肝脏ANGPTL3成功,通过小鼠肝脏HE染色结果显示敲低肝脏ANGPTL3能够明显减缓酒精造成的肝脏损伤,同时对小鼠血清进行了TG/T-CHO/ALT/AST检测,进一步验证敲低肝脏ANGPTL3能够减弱酒精对肝脏的损伤作用。
4. ANGPTL3在体内体外促炎作用的验证
在病毒感染成功,肝脏ANGPTL3敲低和高斌法酒精性肝损伤模型建立成功的基础上,通过ELISA方法检测了各组小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平,通过real-time PCR方法检测各组小鼠肝脏组织中IL-1β、IL-6、TNF-α在mRNA水平上上的变化,结果显示:敲低肝脏ANGPTL3的表达显著降低肝脏炎症因子的表达。
与此同时使用siRNA-ANGPTL3转染RAW264.7细胞,以下调ANGPTL3在RAW264.7细胞中的表达,并进一步通过western blot方法检测ANGPTL3、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达水平,通过real-time PCR方法检测ANGPTL3、IL-1β、IL-6、TNF-α基因水平上的变化。结果显示:沉默ANGPTL3后,细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平明显降低。在此基础上我们通过western blot技术检测了P65和p-P65的表达,发现沉默ANGPTL3能够显著降低P65和p-P65的表达。结果显示:沉默ANGPTL3通过抑制P65和p-P65的表达从而抑制炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达,从而在巨噬细胞中发挥抗炎的作用。
体内体外结果均显示ANGPTL3在酒精性肝损伤中发挥着促炎的作用,而敲低或沉默ANGPTL3之后,炎症指标显著降低。
5.酒精性肝损伤中,巨噬细胞分泌的ANGPTL3通过促进肝细胞凋亡而加重肝损伤。
作为分泌性蛋白,我们通过NTA检测了巨噬细胞外泌体的粒径及纯度,通过电镜我们观察到巨噬细胞外泌体的形态,另外通过免疫电镜及western blot检测到ANGPTL3存在于巨噬细胞外泌体中。为进一步探究ANGPTL3在酒精性肝损伤中的作用,我们通过TUNEL染色发现敲低ANGPTL3的小鼠肝细胞凋亡率明显降低。体外实验采用重组蛋白ANGPTL3及酒精给予AML-12细胞,发现ANGPTL3促进酒精引起的AML-12的凋亡。
为进一步探究ANGPTL3在酒精性肝损伤中的作用。本研究采用C57BL/6J小鼠、RAW264.7细胞株、AML-12细胞株作为研究对象,经体内体外实验观察ANGPTL3对酒精性肝损伤中肝脏巨噬细胞及肝细胞的作用。本课题主要研究内容包含以下五个部分:
1.酒精性肝损伤小鼠模型的建立及ANGPTL3在小鼠肝脏及血清中的表达
本研究首先通过小鼠肝脏切片的HE染色结果判断造模成功,然后采用原位灌流的方法分别分离出小鼠肝脏肝细胞、肝星状细胞、肝脏巨噬细胞,并选用western blot检测ANGPTL3在蛋白水平上的表达及选用real-time PCR检测ANGPTL3的mRNA水平,同时通过肝脏的免疫组化及小鼠血清ELISA检测ANGPTL3在肝脏及血清中的表达。发现ANGPTL3在酒精性肝损伤肝脏及血清中呈现高表达,其表达在小鼠肝脏肝星状细胞中无表达,小鼠肝脏肝细胞中的变化不明显,而在小鼠肝脏巨噬细胞中蛋白及mRNA水平均明显上调。
2. ANGPTL3在RAW264.7细胞株、AML-12细胞株及HSCs中的表达
本研究首先采用CCK-8方法摸索了酒精对RAW264.7细胞和AML-12细胞的最适浓度,通过western blot方法发现在最适浓度酒精的刺激下ANGPTL3的表达在AML-12细胞中几乎没有变化,在RAW264.7细胞中的表达显著升高,且real-time PCR结果显示在酒精和LPS共同刺激之下升高的最明显,而ANGPTL3在HSC-LX2和HSC-T6中均无表达。另外,通过免疫荧光的方法发现ANGPTL3在酒精和LPS刺激的RAW264.7细胞中呈现高表达。
以上结果显示体外验证的结果与体内验证一致,说明在酒精性肝损伤中, ANGPTL3的升高主要是肝脏巨噬细胞中ANGPTL3表达升高所致。
3.体内验证ANGPTL3在酒精性肝损伤中的作用
通过尾静脉注射AAV8-m-ANGPTL3 shRNA-GFP对小鼠肝脏ANGPTL3进行敲低并注射AAV8-GFP(NC group)作为对照组。高斌法酒精性肝损伤模型建立后,通过对肝脏组织的冰冻切片验证病毒感染成功,通过小鼠体重变化及肝重比体重验证造模成功,通过ELISA检测了小鼠血清及肝脏中ANGPTL3水平验证尾静脉注射AAV8-m-ANGPTL3 shRNA-GFP敲低肝脏ANGPTL3成功,通过小鼠肝脏HE染色结果显示敲低肝脏ANGPTL3能够明显减缓酒精造成的肝脏损伤,同时对小鼠血清进行了TG/T-CHO/ALT/AST检测,进一步验证敲低肝脏ANGPTL3能够减弱酒精对肝脏的损伤作用。
4. ANGPTL3在体内体外促炎作用的验证
在病毒感染成功,肝脏ANGPTL3敲低和高斌法酒精性肝损伤模型建立成功的基础上,通过ELISA方法检测了各组小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平,通过real-time PCR方法检测各组小鼠肝脏组织中IL-1β、IL-6、TNF-α在mRNA水平上上的变化,结果显示:敲低肝脏ANGPTL3的表达显著降低肝脏炎症因子的表达。
与此同时使用siRNA-ANGPTL3转染RAW264.7细胞,以下调ANGPTL3在RAW264.7细胞中的表达,并进一步通过western blot方法检测ANGPTL3、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达水平,通过real-time PCR方法检测ANGPTL3、IL-1β、IL-6、TNF-α基因水平上的变化。结果显示:沉默ANGPTL3后,细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平明显降低。在此基础上我们通过western blot技术检测了P65和p-P65的表达,发现沉默ANGPTL3能够显著降低P65和p-P65的表达。结果显示:沉默ANGPTL3通过抑制P65和p-P65的表达从而抑制炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达,从而在巨噬细胞中发挥抗炎的作用。
体内体外结果均显示ANGPTL3在酒精性肝损伤中发挥着促炎的作用,而敲低或沉默ANGPTL3之后,炎症指标显著降低。
5.酒精性肝损伤中,巨噬细胞分泌的ANGPTL3通过促进肝细胞凋亡而加重肝损伤。
作为分泌性蛋白,我们通过NTA检测了巨噬细胞外泌体的粒径及纯度,通过电镜我们观察到巨噬细胞外泌体的形态,另外通过免疫电镜及western blot检测到ANGPTL3存在于巨噬细胞外泌体中。为进一步探究ANGPTL3在酒精性肝损伤中的作用,我们通过TUNEL染色发现敲低ANGPTL3的小鼠肝细胞凋亡率明显降低。体外实验采用重组蛋白ANGPTL3及酒精给予AML-12细胞,发现ANGPTL3促进酒精引起的AML-12的凋亡。