论文部分内容阅读
酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是由于长期大量饮酒引起的一系列肝脏疾病,主要分为早期的酒精性脂肪肝,进而发展成为酒精性肝炎和酒精性肝纤维化,最后形成肝硬化的过程。酒精性肝病病程较长且机制复杂,又由于缺乏理想的动物模型,其调控机制尚未能完全阐明。目前的学术观点认为酒精性肝病的发病机制主要包括肝脂肪变性、氧化应激、乙醛诱导的毒性、细胞因子和趋化因子诱导的毒性等,而肝纤维化是酒精性肝病进程中的重要事件,因为它是进展为肝硬化的先决条件,也是可逆恢复的关键环节。肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)在肝纤维化形成过程中发挥重要作用。在酒精性肝纤维化发生过程中,乙醇可通过代谢毒性产物、氧化应激、细胞因子相互作用等多种因素激活肝星状细胞。肝星状细胞活化增殖是肝纤维化发生、发展的中心环节,抑制肝星状细胞活化增殖成为防治肝纤维化形成的关键。有研究表明刺激肝星状细胞表面的腺苷受体促进肝星状细胞的活化增殖,而腺苷(Adenosine)来源于三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)在胞外核苷酸酶CD39和CD73等酶的水解,参与调节机体的许多生理和病理过程。然而,关于ATP-腺苷信号通路在酒精诱导的肝纤维化中的作用知之甚少。
目的:(1)探究ATP-腺苷信号通路是否参与酒精性肝纤维化的发生和发展;(2)探究增加或减少腺苷的含量对肝纤维化的进程是否有影响及其可能机制。
方法:(1)体内实验。选用8~10周龄雄性C57BL/6小鼠(体重20g±2g)通过慢性持续酒精饲料喂养8周加每周两次急性酒精灌胃复制慢性酒精性肝纤维化模型(高斌模型)。实验分为对照组(Pair-fed,n=12),酒精组(EtOH-fed,n=12),CD73拮抗剂5-(α,β-methylene adenosine)(APCP)低剂量组(APCP-L,1mg/kg,n=12),中剂量组(APCP-M,3mg/kg,n=12),高剂量组(APCP-H,10mg/kg,n=12)以及阳性对照药秋水仙碱组(Colchicine,0.2mg/kg,n=12)。第5周至第8周,对各拮抗剂组小鼠腹腔注射相应剂量的APCP和Colchicine,对照组和酒精组给予相应体积的0.9%生理盐水,每天下午一次。第9周清早将小鼠麻醉后杀死,收集血清和肝脏。采用酶标仪比色法分别检测ALT,AST,HA和LN血清水平;采用HE染色法和Masson染色法观察肝脏切片组织病理变化;采用免疫组化染色法检测肝脏α-SMA表达;Western blot和RT-qPCR检测肝脏CD73,CollagenI,CollagenIII,TGF-β1表达水平;酶联免疫试剂盒法测定血清中ATP和腺苷的浓度。(2)体外实验。采用200μM乙醛刺激大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)48小时复制酒精性肝纤维化细胞模型。分别以外源性ATP(1mM)、外源性腺苷(30μM)、CD73特异性抑制剂APCP(100μM)、腺苷脱氨酶(ADA,1unit/ml)与HSC-T6共培养30min。提取各不同刺激组细胞总蛋白和总mRNA,采用Western blot和RT-qPCR检测CD73,Collagen I,Collagen III,TGF-β1表达水平;酶联免疫试剂盒法测定细胞培养液上清中ATP和腺苷的浓度。
结果:(1)与对照组相比,酒精喂养组小鼠血清中ALT,AST,HA和LN水平明显上升,病理切片可见活化的肝星状细胞及条索状的纤维胶束,CD73,Collagen I,Collagen III,TGF-β1蛋白和基因表达水平均显著上调,提示造模成功,同时ATP和腺苷的浓度也有明显升高,表明ATP和腺苷参与酒精所致的肝纤维化进程。与酒精喂养组相比,高剂量APCP和秋水仙碱明显延缓了肝脏纤维化的进度,且呈现剂量依赖的趋势。(2)HSC-T6细胞经200μM乙醛刺激后,CD73,Collagen I,Collagen III,TGF-β1蛋白和基因表达水平均显著上调,提示细胞模型复制成功。在加入外源性ATP和腺苷后,细胞活化增殖明显加快,伴随纤维化相关指标上调。而在加入APCP和ADA后,则呈现相反的趋势。
结论:(1)ATP-腺苷信号通路参与酒精性肝纤维化过程;(2)CD73拮抗剂APCP通过抑制ATP向腺苷方向的代谢以延缓酒精诱导的肝纤维化过程。
目的:(1)探究ATP-腺苷信号通路是否参与酒精性肝纤维化的发生和发展;(2)探究增加或减少腺苷的含量对肝纤维化的进程是否有影响及其可能机制。
方法:(1)体内实验。选用8~10周龄雄性C57BL/6小鼠(体重20g±2g)通过慢性持续酒精饲料喂养8周加每周两次急性酒精灌胃复制慢性酒精性肝纤维化模型(高斌模型)。实验分为对照组(Pair-fed,n=12),酒精组(EtOH-fed,n=12),CD73拮抗剂5-(α,β-methylene adenosine)(APCP)低剂量组(APCP-L,1mg/kg,n=12),中剂量组(APCP-M,3mg/kg,n=12),高剂量组(APCP-H,10mg/kg,n=12)以及阳性对照药秋水仙碱组(Colchicine,0.2mg/kg,n=12)。第5周至第8周,对各拮抗剂组小鼠腹腔注射相应剂量的APCP和Colchicine,对照组和酒精组给予相应体积的0.9%生理盐水,每天下午一次。第9周清早将小鼠麻醉后杀死,收集血清和肝脏。采用酶标仪比色法分别检测ALT,AST,HA和LN血清水平;采用HE染色法和Masson染色法观察肝脏切片组织病理变化;采用免疫组化染色法检测肝脏α-SMA表达;Western blot和RT-qPCR检测肝脏CD73,CollagenI,CollagenIII,TGF-β1表达水平;酶联免疫试剂盒法测定血清中ATP和腺苷的浓度。(2)体外实验。采用200μM乙醛刺激大鼠肝星状细胞株(HSC-T6)48小时复制酒精性肝纤维化细胞模型。分别以外源性ATP(1mM)、外源性腺苷(30μM)、CD73特异性抑制剂APCP(100μM)、腺苷脱氨酶(ADA,1unit/ml)与HSC-T6共培养30min。提取各不同刺激组细胞总蛋白和总mRNA,采用Western blot和RT-qPCR检测CD73,Collagen I,Collagen III,TGF-β1表达水平;酶联免疫试剂盒法测定细胞培养液上清中ATP和腺苷的浓度。
结果:(1)与对照组相比,酒精喂养组小鼠血清中ALT,AST,HA和LN水平明显上升,病理切片可见活化的肝星状细胞及条索状的纤维胶束,CD73,Collagen I,Collagen III,TGF-β1蛋白和基因表达水平均显著上调,提示造模成功,同时ATP和腺苷的浓度也有明显升高,表明ATP和腺苷参与酒精所致的肝纤维化进程。与酒精喂养组相比,高剂量APCP和秋水仙碱明显延缓了肝脏纤维化的进度,且呈现剂量依赖的趋势。(2)HSC-T6细胞经200μM乙醛刺激后,CD73,Collagen I,Collagen III,TGF-β1蛋白和基因表达水平均显著上调,提示细胞模型复制成功。在加入外源性ATP和腺苷后,细胞活化增殖明显加快,伴随纤维化相关指标上调。而在加入APCP和ADA后,则呈现相反的趋势。
结论:(1)ATP-腺苷信号通路参与酒精性肝纤维化过程;(2)CD73拮抗剂APCP通过抑制ATP向腺苷方向的代谢以延缓酒精诱导的肝纤维化过程。