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背景和目的 Musashi-2(MSI2)是Musashi基因家族的一个进化相对保守的RNA结合蛋白,对维护干细胞功能和状态具有重要生理意义。在慢性髓系细胞白血病(CML)、急性髓系细胞白血病(AML)及正常造血干细胞中已经证实MSI2能促进细胞生长和维持细胞干性的作用,MSI2高表达是B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)不良预后指标,可能与T-ALL原发性耐药密切相关。但在ALL中MSI2的功能及具体分子机制尚不清楚。MSI2不仅能与蛋白编码基因m RNA结合参与翻译调控,还能与线性长非编码RNA(Lnc RNA)结合参与调控。但MSI2能否调控circ RNA,仍需进一步研究。研究方法 1.MSI2sh RNA慢病毒感染ALL细胞NALM6,通过PCR与western blot验证基因下调。2.检测MSI2下调后NALM6细胞生长、周期和凋亡变化。3.在NALM6细胞中,干扰MSI2基因,western blot检测NUMB、p53、LEF1的改变。4.为了探究MSI2与p53的关系,在p53缺失的细胞HL-60中下调MSI2基因,观察其对NUMB、LEF1表达的影响。5.选择MSI2小干扰最为显著的HL-60,小干扰后进行circ RNA芯片检测,筛选出表达差异显著的cir RNA。6.根据芯片检测结果,挑选差异最显著且表达较高的16个circ RNA,在HL-60和NALM6细胞中用PCR检测验证其表达差异。研究结果 1.用MSI2sh RNA慢病毒感染ALL细胞NALM6后,PCR和Western blot证实sh RNA组MSI2在m RNA水平和蛋白水平明显下调。2.MSI2下调后,观察NALM6细胞1、3、5天的生长率,对照组的相对细胞生长率分别为1.27±0.012、2.48±0.035、4.21±0.023;小干扰组分别为1.24±0.038、2.35±0.049、3.8±0.036,第5天开始小干扰组细胞株生长与无关序列有明显差异,P<0.05。3.NALM6细胞中,无关序列组的凋亡率为0.96±0.21%,sh RNA组的凋亡率为3.1±0.46%,P<0.05,且凋亡蛋白PARP剪切较NC升高,流式证实sh RNA组的凋亡百分比增加;MSI2下调后能使NALM6细胞阻滞在G0/G1期,MSI2小干扰后能下调周期蛋白CDK4表达,上调p21蛋白表达。4.在NALM6细胞中,沉默MSI2基因后,发现NUMB、p53上调,Wnt信号中的LEF1蛋白水平下调。5.在p53缺失的HL-60细胞中,沉默MSI2基因后,观察第1、2、3、4天的生长率,对照组的相对细胞生长率分别为1.931±0.064、3.07±0.09、4.017±0.058和4.215±0.032,小干扰组分别为1.927±0.012、2.564±0.035、2.825±0.023和3.223±0.042,第3天开始小干扰组细胞株生长与对照组有明显差异,P<0.05;MSI2下调后,细胞凋亡增加,周期阻滞在G0/G1期,NUMB上调,LEF1水平也出现下降。6.沉默HL-60细胞的MSI2基因,能发现183个circ RNA出现上调,86个circ RNA发生下调(FC≥2)。挑选芯片显示差异最显著而且表达丰度高的16个circ RNA,用PCR进行验证,结果显示,在HL-60细胞中,与芯片结果一致并表达差异大于2倍的circ RNA只有ci-001214,sh RNA组较对照组表达差异为3.48倍,而在NALM6细胞中,sh RNA组较对照组表达差异为1.57倍。结论 我们的研究结果表明,MSI2sh RNA能抑制NALM6细胞生长,能上调p53和NUMB表达,下调LEF1表达,但p53-wnt在MSI2分子机制中并未起关键性作用。沉默MSI2能急剧上调ci-001214的表达。这些结果进一步揭示了MSI2在ALL中分子作用机制,也为MSI2调控circ RNA提供依据。