研究背景动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）作为一种常见的心血管疾病,其发生发展是程复杂,主要包括:内皮细胞损伤及功能异常,脂质沉积以及平滑肌细胞的增殖迁移等过程。巨噬细胞泡沫细胞的形成是AS早期病变的特征,氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）在清道夫受体（SRs）的帮助下被巨噬细胞摄入并沉积在胞内形成泡沫细胞。Ox-LDL可诱导包括CD36、清道夫受体A（SR-A）的表达上调。CD36在巨噬细胞中表达较多,属于B类清道夫受体大家庭中的一员。Ox-LDL、凋亡细胞和晚期糖基化终末产物（AGEs）可与CD36相互作用参与AS发生发展过程。此外,有报道称:SR-A作为SR家族中的一种细胞表面糖蛋白,可以加速AS的发生发展。WNT信号通路是一个相对传统的信号通路,有研究发现它参与了内皮细胞和单核细胞之间的粘附,调节了平滑肌细胞的功能,促进血管钙化,并且在细胞的成脂分化中扮演着重要作用。Wnt1诱导的信号通路蛋白1（WISP1）属于细胞外基质蛋白CCN家族,是经典WNT信号通路的下游靶基因。在体内多个器官中有表达,主要参与胚胎发育、细胞增殖迁移、炎症反应及组织修复等重要病理生理过程。有研究发现WISP 1的表达在氧化应激的神经元中表达显著增加;此外,有研究证明WISP1可以使血管平滑肌细胞的迁移率增加,进而起到使血管内膜增厚的作用。另有研究表明,肥胖可导致WISP1的上调,而肥胖和AS关系密切,但WISP1是否在AS中发挥作用尚不清楚。本研究旨在探讨WISP1与AS斑块发生发展的关系及其相关分子生物学机制,从而为AS的预防和治疗提供新的干预靶点。研究目的1.探究动脉粥样硬化模型中WISP1对其斑块形成的影响以及机制。2.探究巨噬细胞中WISP1对其脂质沉积的影响以及机制。3.探究ox-LDL对巨噬细胞中WISP1表达的影响及其机制。研究方法为了探究WISP1与AS斑块发生发展的关系及其相关分子生物学机制,我们将通过体内和体外两部实验来进行验证。体内实验主要是在ApoE-/-小鼠中进行,将小鼠分为5组:对照组（control组）、高脂饮食组（HFD组）、空慢病毒组（NC组）、慢病毒WISP1组（IvWISP1组）和WISP1-shRNA组（shWISP1组）,其中除control组外均进行高脂喂养,慢病毒转染12周后取材,对主动脉窦进行油红O染色、CD36免疫荧光和MOMA2、WISP1免疫组化,血清学检测指标主要有总胆固醇（TC）,低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）,高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。细胞实验主要使用巨噬细胞（RAW264.7细胞系和腹腔巨噬细胞）,用50 μg/mL的ox-LDL刺激巨噬细胞后检测活性氧（ROS）水平。慢病毒转染巨噬细胞后使用油红O染色和dil-ox-LDL（Dil染色的ox-LDL）摄取实验来检测巨噬细胞脂质含量。体内和体外实验中均使用Western blotting和ELISA检测WISP1、CD36、SR-A和PPARγ的表达水平。研究结果1.小鼠的一般情况在HFD组中,小鼠体重、TC、LDL-C的水平显著高于control组,HDL-C水平低于control组;而HFD组、NC组、IvWISP1组和shWISP1各组之间的体重和血脂水平并无明显差异,表明WISP1对小鼠的体重和血脂水平并无明显作用。2.WISP1慢病毒转染后对动脉粥样硬化主动脉斑块内脂质沉积的影响小鼠主动脉根部冰冻切片以及主动脉大体油红O染色结果显示:HFD组斑块面积显著高于control组,IvWISP1组的斑块面积显著低于NC组,而shWISP1组较NC组则明显增高。综上所述WISP1可延缓动AS斑块中脂质沉积。3.WISP1慢病毒转染后对小鼠主动脉根部斑块内巨噬细胞的影响小鼠主动脉根部冰冻切片MOMA-2免疫组化结果显示,HFD组中斑块的巨噬细胞数量显著高于control组,巨噬细胞的含量在shWISP1组的巨噬含量相较于NC组显著升高。综上所述,WISP1可下调斑块中巨噬细胞数目。4.WISP1慢病毒转染后能显著影响CD36和SR-A的表达小鼠主动脉根部冰冻切片CD36免疫荧光结果显示,HFD中斑块的CD36含量明显高于control组、IvWISP1组斑块中CD36含量显著低于NC组,而shWISP1组则明显高于NC组。主动脉组织的western blot结果显示,HFD组中CD36、SR-A蛋白含量明显高于control组,IvWISP1组的CD36、SR-A蛋白表达量明显低于NC组。因此,WISP1可明显下调主动脉瓣当中SR-A、CD36的表达。5.高脂喂养增加WISP1表达及机制小鼠主动脉组织western blot结果显示,HFD组中的Wnt5a、β-catenin、WISP1的含量显著高于control组,我们可以得出高脂喂养可以通过活化Wnt5a/β-catenin信号通路,从而上调WISP 1的表达。6.Ox-LDL通过刺激巨噬细胞中ROS的产生,进而活化Wnt5a/β-catenin信号通路最终上调WISP1的表达将巨噬细胞用ox-LDL干预后,通过检测ROS水平发现:与对照组相比,ox-LDL可以促进ROS的产生,同时Wnt5a、β-catenin、WISP1的表达明显升高;进一步我们使用 ROS 抑制剂 NAC 发现,与 ox-LDL 相比,ox-LDL+NAC 组的 Wnt5a、β-catenin、WISP1的水平显著降低。综上所述,我们可以得出:ox-LDL可以刺激巨噬细胞中的ROS的产生,进一步活化Wnt5a/β-catenin信号通路来上调巨噬细胞中的WISP1。7.WISP1通过PPARγ/CD36信号通路调控巨噬细胞脂质沉积巨噬细胞蛋白western blot结果显示,IvWISP1组的PPARγ、CD36表达量显著低于NC组。ShWISP1组中的PPARγ、CD36显著高于NC组,且巨噬细胞中脂质含量也明显高于NC组;而这种由于干扰WISP1所引起的上调作用可被PPARγ信号通路的抑制剂T0070907所抑制,连同其促进的巨噬细胞脂质沉积一起被抑制。这表明,过表达WISP1可通过抑制PPARγ/CD36信号通路来抑制巨噬细胞脂质沉积。研究结论1.WISP1在动脉粥样硬化斑块中表达上调。2.WISP1可延缓动脉粥样硬化斑块的发生发展。3.WISP1可减少动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的数量。4.Ox-LDL 可通过 ROS 来激活 wnt5a/β-catenin进而上调 WISP1。5.WISP1可通过抑制PPARy/CD36和SR-A来抑制巨噬细胞内脂质沉积。研究背景动脉粥样硬化（AS）作为不稳定型心绞痛、心肌梗塞和猝死的主要原因,是人类生命的头号杀手[1-3]。AS斑块破裂和血栓阻塞是急性冠状动脉综合征及中风的主要原因。易损斑块是内含大量巨噬细胞和淋巴细胞[4],且纤维帽较薄含少量的平滑肌细胞（SMCs）[5]。通过谱系追踪研究发现纤维帽内的细胞来自血管平滑肌细胞,这些来自VSMC的纤维帽细胞成为纤维帽中胶原蛋白的主要来源,形成的纤维帽具有强机械拉力和抗破裂能力[6]。因此,AS斑块的稳定性是该疾病进展恶化的关键,在粥样硬化治疗中具有非常重大的临床价值。VSMC的增殖迁移对斑块的稳定性至关重要,而整合素又在介导VSMC黏附和迁移过程中发挥着巨大作用[7]。整合素,是一种细胞外基质蛋白（ECM）的受体,它不光可以通过一定的整合作用将细胞外的刺激信号传递到细胞内,还可以介导细胞与细胞之间以及细胞与ECM的相互作用。粘着斑激酶（FAK）,作为整合素信号传递过程中连接整合素与其下游信号分子的关键蛋白,是细胞内多条信号通路的交汇点。当配体与整合素结合后可导致FAK的磷酸化,进一步激活MEK/ERK信号通路,从而参与包括增殖迁移在内的多种细胞功能。当该通路被抑制时,多种细胞的增殖迁移也会被阻止[8-10]。作为另一个与细胞增殖迁移密切相关的蛋白家族,MAPK/ERK信号的激活亦能促进VSMC的增殖迁移[11-12]。Wnt1诱导信号通路蛋白1（WISP1）可以参与细胞凋亡、自噬、细胞迁移、增殖、血管生成、免疫调节和肿瘤发生等细胞机制。有研究发现WISP1可以协助Wnt2诱导的促VSMCs的迁移,从而使血管内膜增厚[13]。此外,WISP1可以通过调节皮肤成纤维细胞的迁移和ECM的表达来加速伤口愈合[14,15]。然而,WISP1在促进VSMC的增殖迁移的机制研究还不够完善,并且WISP1对AS斑块稳定性的研究国内外还未见报道。本研究旨在通过体内体外实验来探讨WISP1与AS斑块稳定性的关系及其相关分子机制。研究目的1.通过慢病毒转染WISP1,研究WISP1对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响。2.探究WISP1对血管平滑肌细胞增殖迁移的影响。3.探究WISP1对整合素α5β1,FAK/MEK/ERK信号通路的影响。4.探究WISP1对MAPK信号通路的影响。研究方法为了探究WISP1与AS斑块稳定性的关系及其相关分子机制,我们将通过体内和体外两部分实验进行。体内实验我们在ApoE-/-小鼠中进行,将小鼠分为三组,依次为:空慢病毒组（NC）、WISP1慢病毒过表达组（IvWISP1）和WISP1慢病毒干扰组（shWISP1）,对小鼠进行颈动脉套管8周后局部转染慢病毒,病毒转染4周后取材,对套管部位颈动脉做冰冻切片后行油红O染色,天狼星红染色,Masson染色以及MOMA2和α-SMA的免疫荧光染色,从而评估斑块稳定性。体外实验主要是在VSMC中进行,通过对VSMC转染慢病毒以及Transwell、CCK8实验来探究WISP1对VSMC增殖迁移的影响,并通过western blot和相关信号通路抑制剂来探究WISP1与整合素α5β1、FAK/MEK/ERK信号通路的关系及其对细胞增殖迁移的影响。研究结果1.小鼠的一般情况NC组,IvWISP1组和shWISP1各组之间的体重和血清TC、LDL-C、HDL-C水平并无明显差异,表明局部浸润WISP1慢病毒对ApoE-/-小鼠的体重和血脂水平并无明显作用。2.WISP1对小鼠颈动脉内巨噬细胞及脂质含量的影响通过对小鼠颈动脉套管部位冰冻切片行MOMA-2免疫荧光及油红O染色检测巨噬细胞以及脂质含量,结果显示:IvWISP1组颈动脉斑块中巨噬细胞数量及脂质含量显著低于NC组,而shWISP1组的则显著高于NC组。综上所述,WISP1可抑制颈动脉斑块中巨噬细胞聚集及脂质沉积。3.WISP1对小鼠颈动脉内平滑肌细胞的影响通过对小鼠颈动脉套管部位冰冻切片行α-SMA的免疫荧光、Masson以及天狼星红染色检测平滑肌以及胶原含量,结果显示:IvWISP1组斑块中的平滑肌细胞数量及胶原含量明显高于NC组,而shWISP1组则显著低于NC组。综上所述,WISP 1可增加斑块中平滑肌细胞数目。4.WISP1对小鼠颈动脉斑块稳定性的影响通过对斑块易损指数的计算来评估斑块稳定性,我们可以得出:IvWISP1组的易损指数显著低于NC组,而shWISP1组显著高于NC组。综上所述:WISP1可以稳定颈动脉部位的粥样斑块。5.WISP1对VSMC增殖迁移的影响通过Transwell实验、划痕实验和CCK8来观察VSMC的增殖迁移能力。结果显示:IvWISP1组增殖迁移的VSMC数目较NC组明显增加,而shWISP1组较NC组明显减少。综上所述,WISP1可显著促进VSMC的增殖迁移。6.WISP1对MAPK信号通路的影响通过western blot检测VSMC内MAPK信号通路磷酸化水平,结果发现:IvWISP1组ERK的磷酸化水平明显高于NC组,而shWISP1则明显低于NC组。而IvWISP1,NC,shWISP1三组的P38,JNK磷酸化水平无明显差异。综上所述,WISP1可以显著促进ERK磷酸化,但WISP1对P38及JNK磷酸化水平无明显作用。7.WISP1通过整合素α5β1调控FAK及其下游MEK,ERK信号通路磷酸化进而影响VSMC增殖迁移。通过western blot检测VSMC内WISP1对FAK/MEK/ERK磷酸化影响,并进一步使用整合素α5β1拮抗剂Abα5β1以及FAK信号通路抑制剂Y15来下调整合素α5β1和FAK信号通路磷酸化,结果发现:相比于NC组,IvWISP1组FAK,MEK,ERK的磷酸化水平明显升高,增殖迁移的VSMC数目也明显增加,而这种被提高了的磷酸化水平以及被促进了的VSMC增殖迁移水平在使用了 Abα5β1及Y15后均得到了抑制。综上所述,WISP1可以通过整合素α5β1来激活FAK信号通路磷酸化,磷酸化的FAK进一步激活MEK、ERK通路最终促进VSMC的增殖迁移。研究结论1.WISP1增加动脉粥样硬化斑块的稳定性。2.WISP1促进血管平滑肌细胞的增殖迁移。3.WISP1通过整合素α5β1激活FAK,进而激活其下游MEK/ERK信号通路,从而促进血管平滑肌细胞的增殖迁移。