微生物次级代谢产物是抗菌、抗肿瘤、免疫调节、杀虫等药物的重要来源。利用基因编辑技术克隆和改造次级代谢产物生物合成基因簇是发现新药物,提高药物产量和改良药物结构的重要方法。微生物次级代谢产物生物合成基因簇一般大于20kb,包含基因数量多,而且一般含有大量重复序列,改造难度大,因此,开发高效克隆和改造基因簇的基因编辑技术一直是天然药物合成生物学关注的热点。ExoCET克隆技术联合核酸外切酶介导的体外同源重组和大肠杆菌RecET重组酶介导的细胞内同源重组,不仅能从微生物基因组中靶向抓取＞100 kb的大片段,还能高效组装＞13个DNA片段,是DNA克隆和组装的有力工具。利用ExoCET技术克隆或者组装的基因簇可以在大肠杆菌中通过丰富的Red/ET重组工具箱进行修饰,例如插入基因转移元件、替换启动子、删除/插入调控基因等,实现在多种宿主的异源表达。还可以通过结构域点突变或模块替换进行组合生物合成以获得更多衍生物。大规模基因组测序揭示微生物基因组中含有大量亟待挖掘的天然产物的生物合成基因簇（Biosynthetic geneclusters,BGCs）,它们合成的聚酮（Polyketides,PKs）、非核糖体肽（Nonribosomal Peptides,NRPs）、核糖体合成和翻译后修饰肽（Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides,RiPPs）和萜类等化合物将有可能被开发为新药物。微生物基因组的GC含量在13.5%～77%之间,高GC含量放线菌以能产生大量活性天然产物著称,＞65%的微生物天然产物来源于放线菌。海洋蓝细菌也已被证明是天然产物的重要来源之一,在海洋蓝细菌中分离出的天然产物包括抗肿瘤化合物Apratoxins、Coibamides,Curacins和Largazoles等。由于海洋蓝细菌遗传操作困难,而且很多基因组AT含量较高导致基因簇克隆困难等因素限制了其基因组资源的进一步挖掘。开发这些生物基因组中的生物合成资源需要更通用和便利的克隆技术。在前期研究中我们发现GC含量对不同DNA体外同源重组技术的效率影响较大,进而影响联合使用体外同源重组和细胞内同源重组的ExoCET技术的克隆效率。因此在本研究中,我们优化了 ExoCET技术体系,建立了更适合高AT含量基因组大片段的直接克隆和多片段组装的ExoCET-BAC策略。我们以AT含量为69%的海洋蓝细菌原绿球藻MIT 9301菌株的基因组为研究对象,探究了利用ExoCET技术进行高AT含量基因组大片段克隆的最佳条件。在核酸外切酶介导的体外同源重组时使用Gibson体系较T4聚合酶体系能获得更高的克隆效率。同时也研究了克隆高AT含量DNA时,克隆载体拷贝数与克隆效率的关系,选择单拷贝的细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosome,BAC）比多拷贝载体克隆效果更好,以此建立了 ExoCET-BAC策略。利用ExoCET-BAC技术成功地从原绿球藻基因组上抓取＞80kb的大片段,并且能以100%的正确率组装11个3 kb的DNA片段,也可以一步同时抓取4个7-20 kb的基因组大片段。该研究建立的ExoCET-BAC策略将为高AT含量生物的基因组功能研究提供了高效使能技术。本研究还成功利用ExoCET技术组装了高GC含量的盐霉素多操纵子人工基因簇,实现了盐霉素的高效异源表达。盐霉素是从白色链霉菌中分离的一种聚醚类抗生素,它对肿瘤干细胞的选择性抑制活性显示出了盐霉素可以作为癌症治疗化合物的潜力。肿瘤干细胞是一种独特的癌细胞亚群,存在于许多液体和实体肿瘤中。它们对各种疗法具有抗性,并推动肿瘤的发生、发展、转移和复发。经研究发现,盐霉素对乳腺癌干细胞的抑制活性比紫杉醇高100倍。但是盐霉素对神经干细胞和造血干细胞的潜在毒副作用,是限制其临床应用的主要障碍。一系列不同活性的盐霉素结构衍生物是研究构效关系用于开发高治疗作用低毒副作用抗癌药物的关键。由于盐霉素结构复杂,很难利用化学手段对其进行结构衍生,因此改造其生物合成基因簇是获得更多衍生物的重要方法。在本研究中,我们首先将前期利用ExoCET技术克隆的盐霉素基因簇转入三种异源表达宿主S.lividans K4-114、S.albus J1074 和 S.coelicolor CH999 中,发现 S.albus J1074 中产量最高为0.5 mg L-1,S.lividansK4-1 14和S.coelicolor CH999中几乎检测不到产物。为了提高盐霉素的异源表达产量,我们利用ExoCET组装技术构建了一个具有6个操纵子的106kb的人工盐霉素基因簇,这6个操纵子包括:（1）salAI-IXPKS基因;（2）乙基丙二酰辅酶A合酶基因（salP、salQ）和硫酯酶基因（salGI、salGII）;（3）编码可能的酰基载体蛋白的salX基因、环氧化物酶基因salC和环氧化物水解酶/环化酶基因salBⅠ-Ⅲ;（4）细胞色素P450基因salD、铁氧还蛋白基因salF、脱水酶基因salE和转运基因（salH、SalI）;（5）调控基因salJ和salO;（6）来源于S.albus DSM41398基因组上5个脂肪酸β-氧化基因SLNWT5323、SLNWT5008、SLNWT850、SLNWT400 和 SLNWT812,来源于S.albus J1074 基因组上组成型强启动子SA15p、SA6p、SA2p、SA31p、SA13p和SA28p分别位于每组基因的上游,统一调控基因的转录。通过同时过表达生物合成基因、调控基因、转运基因和脂肪酸β-氧化基因来实现高效表达盐霉素基因簇的目的。多操纵子人工基因簇在异源表达宿主S.lividans K4-114和S.coelicolor CH999中实现了从无产物到产量分别为14.3 mgL-1和10.3 mgL-1。在S.albus J1074中产量达到19.3 mg L-1是原始基因簇产量的38.6倍。此外还研究了调控基因salJ、salN和salO在异源宿主S.albusJ1074中的功能,本研究建立的人工基因簇为盐霉素的结构衍生奠定了重要基础。综上所述,本研究通过优化ExoCET技术使其成功应用于高AT含量微生物基因组大片段克隆和组装,实现了高AT含量原绿球藻基因组大片段的高效获取;也成功利用该技术改造了 106 kb高GC含量的盐霉素生物合成基因簇,显著提高了其异源表达产量,为改造基因簇获得更多衍生物进行构效关系研究奠定了重要基础。基因编辑技术是微生物次级代谢产物研究的重要工具,本研究进一步扩大了 ExoCET技术的应用范围,为微生物天然产物药物研发提供了重要使能技术。