论文部分内容阅读
目的:探讨2型糖尿病患者血管内皮祖细胞胞内活性氧(ROS)、钙离子浓度的改变及栀子苷对内皮祖细胞的保护作用。方法:选取南京军区南京总医院内分泌科2011年07月至2011年09月2型糖尿病(type2diabetes mellitus,T2DM)住院患者20人,健康体检者20人为对照组。40例病例中,女性16例,男性24例,平均年龄(55+3)岁,两组患者一般资料比较差异无统计学意义(P>005),实验组和对照组分别设为四个小组,即:实验组:A1组为空白组(不加药物干预),B1组为栀子苷浓度为12.5mg/L,C1组为栀子苷浓度为25mg/L,D1组为栀子苷浓度为50mg/L。对照组以同样的方法分为A2、B2、C2、D2。取外周血15m1,用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,接种在包被有HFN的细胞培养板上,用M199培养液在37-C温箱培养,每天在显微镜下观察细胞的生长状况,细胞生长至第7天行Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1鉴定,以确定所得到的细胞为正在分化的血管内皮祖细胞。被染成红色的为ac-LDL阳性的细胞,染成绿色的是UEA.1阳性的细胞,能够被双染的细胞即是正在分化的内皮祖。细胞培养第六天进行药物干预,在测定各个指标之前先行(噻唑蓝)MTT检测细胞活性,以证明栀子苷药物本身在一定浓度范围内对细胞无毒性反应。按照MTT的说明书,利用酶标仪检测细胞活性。在细胞培养第7天(药物干预后),用流式细胞仪测定各组细胞内ROS水平,荧光倒置显微镜观察细胞内钙离子荧光强度,每组实验分别行3次独立实验。所有数据用SPSS17.0软件处理,实验结果以均数士标准差(x±s)坷夕表示,统计方法为单因素方差分析和t检验。P<0.05为有统计学意义。结果:1.MTT法测定细胞活性示:栀子苷能明显提高DM患者EPCs的活性(P<0.01)差异有统计学意义。并且100mg/L以下的栀子苷浓度对EPCs无毒性作用,因此选择100mg/L以下的药物浓度进行以下的实验分组,可以排除栀子苷药物本身对EPCs的毒性作用,干扰实验结果。2.流式细胞仪测定细胞内ROS水平示:糖尿病组内皮祖细胞活性氧水平明显高于正常对照组。栀子苷干预组能明显降低细胞内活性氧的水平,12.5mg/L的干预组使细胞内活性氧的平均水平由1247.8降至680.6。3.倒置荧光显微镜观察细胞内钙离子荧光强度并用Imagepro plus6.0图像分析软件计算平均荧光强度,结果示:糖尿病组钙离子平均荧光强度高于对照组,经过栀子苷药物干预后,钙离子平均荧光强度明显降低。12.5mg/L栀子苷浓度使DM组钙离子荧光强度从0.103降至0.086。结论:糖尿病患者外周血血管内皮祖细胞生长缓慢,细胞内ROS产生增加,钙离子负荷超载,而栀子苷能明显提高糖尿病患者外周血血管内皮祖细胞的活力,降低细胞内ROS水平,明显缓解血管内皮祖细胞内的钙离子超载,维持细胞内钙离子稳态,减轻氧化应激导致的细胞毒性,为其用于防治糖尿病病人血管病变提供依据。