糖尿病血管内皮祖细胞内活性氧和钙离子浓度的改变及栀子苷的保护作用

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目的:探讨2型糖尿病患者血管内皮祖细胞胞内活性氧(ROS)、钙离子浓度的改变及栀子苷对内皮祖细胞的保护作用。方法:选取南京军区南京总医院内分泌科2011年07月至2011年09月2型糖尿病(type2diabetes mellitus,T2DM)住院患者20人,健康体检者20人为对照组。40例病例中,女性16例,男性24例,平均年龄(55+3)岁,两组患者一般资料比较差异无统计学意义(P>005),实验组和对照组分别设为四个小组,即:实验组:A1组为空白组(不加药物干预),B1组为栀子苷浓度为12.5mg/L,C1组为栀子苷浓度为25mg/L,D1组为栀子苷浓度为50mg/L。对照组以同样的方法分为A2、B2、C2、D2。取外周血15m1,用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,接种在包被有HFN的细胞培养板上,用M199培养液在37-C温箱培养,每天在显微镜下观察细胞的生长状况,细胞生长至第7天行Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1鉴定,以确定所得到的细胞为正在分化的血管内皮祖细胞。被染成红色的为ac-LDL阳性的细胞,染成绿色的是UEA.1阳性的细胞,能够被双染的细胞即是正在分化的内皮祖。细胞培养第六天进行药物干预,在测定各个指标之前先行(噻唑蓝)MTT检测细胞活性,以证明栀子苷药物本身在一定浓度范围内对细胞无毒性反应。按照MTT的说明书,利用酶标仪检测细胞活性。在细胞培养第7天(药物干预后),用流式细胞仪测定各组细胞内ROS水平,荧光倒置显微镜观察细胞内钙离子荧光强度,每组实验分别行3次独立实验。所有数据用SPSS17.0软件处理,实验结果以均数士标准差(x±s)坷夕表示,统计方法为单因素方差分析和t检验。P<0.05为有统计学意义。结果:1.MTT法测定细胞活性示:栀子苷能明显提高DM患者EPCs的活性(P<0.01)差异有统计学意义。并且100mg/L以下的栀子苷浓度对EPCs无毒性作用,因此选择100mg/L以下的药物浓度进行以下的实验分组,可以排除栀子苷药物本身对EPCs的毒性作用,干扰实验结果。2.流式细胞仪测定细胞内ROS水平示:糖尿病组内皮祖细胞活性氧水平明显高于正常对照组。栀子苷干预组能明显降低细胞内活性氧的水平,12.5mg/L的干预组使细胞内活性氧的平均水平由1247.8降至680.6。3.倒置荧光显微镜观察细胞内钙离子荧光强度并用Imagepro plus6.0图像分析软件计算平均荧光强度,结果示:糖尿病组钙离子平均荧光强度高于对照组,经过栀子苷药物干预后,钙离子平均荧光强度明显降低。12.5mg/L栀子苷浓度使DM组钙离子荧光强度从0.103降至0.086。结论:糖尿病患者外周血血管内皮祖细胞生长缓慢,细胞内ROS产生增加,钙离子负荷超载,而栀子苷能明显提高糖尿病患者外周血血管内皮祖细胞的活力,降低细胞内ROS水平,明显缓解血管内皮祖细胞内的钙离子超载,维持细胞内钙离子稳态,减轻氧化应激导致的细胞毒性,为其用于防治糖尿病病人血管病变提供依据。
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