论文部分内容阅读
目的:检测肝癌耐药细胞的相关特性;肝癌耐药和Notch-1通路的关系;肝癌耐药细胞有无发生EMT,初步探讨Notch-1通路和EMT与肝癌耐药、转移的关系,通过AS2O3联合γ-分泌酶抑制剂MW167对人肝癌HepG2/ADM细胞耐药、迁移和侵袭等研究,探讨AS2O3逆转HepG2/ADM细胞耐药作用与Notch-1信号通路的关系,为丰富肝癌治疗方案、发现新的治疗靶点提供实验依据和理论参考。方法:实验以HepG2细胞和HepG2/ADM细胞为研究对象,分三部分:1.检测两细胞中耐药性相关指标:RT-PCR和Western blot法检测两细胞中耐药(MDR-1/P-gp)、凋亡(Bcl-2、Bax、Survivin)、Notch-1信号通路(Notch-1、Hes-1、NICD)相关基因和蛋白表达。2.研究两细胞在EMT及生物学行为上的表现:倒置荧光显微镜观察对数生长期细胞形态及生长状况,记录并拍照;以RT-PCR、Western blot法检测EMT相关标记物E-cadherin和Vimentin的表达;采用划痕愈合实验、Transwell小室实验及平板克隆形成实验分别观察和检测两细胞迁移、侵袭和克隆形成能力;3.研究干预因素(As2O3和MW167单独以及两药联合)对两细胞增殖(MTT法检测)、耐药、凋亡、Notch-1信号通路、EMT及生物学行为的影响(方法及检测指标同上)。结果:1.与HepG2细胞相比,HepG2/ADM细胞中MDR-1/P-gp、Bcl-2和Survivin mRNA和蛋白高表达(P﹤0.05),Bax mRNA和蛋白呈低表达(P﹤0.05),Notch-1、Hes-1、NICD呈高表达(P﹤0.05)。2.与HepG2细胞相比,HepG2/ADM细胞棱角减少,呈长梭形样改变,细胞间隙增宽,获得间质细胞的形态特征,细胞生长速度减慢;细胞中E-cadherin的表达降低(P﹤0.05),而Vimentin的表达则升高(P﹤0.05);48 h时,划痕面积缩小、划痕愈合率增加(P﹤0.05);Transwell迁移、侵袭实验,穿膜细胞数增加(P﹤0.05);平板克隆形成数增加(P﹤0.05)。3.As2O3、MW167单独和联合方案均可提高HepG2/ADM细胞的增殖抑制率,降低细胞中MDR-1/P-gp、Bcl-2、Survivin、Notch-1、Hes-1、NICD、Vimentin mRNA和蛋白表达(P﹤0.05),增加Bax、E-cadherin mRNA和蛋白的表达(P﹤0.05),降低划痕愈合率,降低迁移、侵袭穿膜细胞数,降低平板克隆形成数(P﹤0.05),且降低或升高趋势呈现联合组﹥单药组﹥对照组(P﹤0.05)。结论:1.HepG2/ADM细胞的耐药性与P-gp、凋亡通路、Notch-1通路以及EMT的发生密切相关;2.As2O3逆转HepG2/ADM细胞耐药机制与Notch-1通路可能存在共同通路或共同作用靶点。