脑缺血-再灌注损伤（Cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI）是脑血管栓塞再通后引起的一种继发性损伤,CIRI会导致神经细胞发生水肿坏死、并导致患者出现严重的神经功能障碍,及时挽救神经细胞是救治脑缺血-再灌注损伤的关键。ZC3H12D（具有CCCH锌指结构域的蛋白质12d,Zinc finger CCCH domain-containing protein 12d）是CCCH型锌指蛋白家族的一员,在肿瘤、炎症反应发生发展中发挥重要作用。我们前期通过高通量二代测序技术发现,ZC3H12D基因在CIRI中差异表达,ZC3H12D可能参与CIRI的发生发展过程,其作用机制有待进一步研究。因此我们拟通过建立在体和离体脑缺血-再灌注损伤模型,采用免疫荧光共染、qRT-PCR、Western Blotting、ELISA等生物技术方法,从现象、功能、机制不同层面对ZC3H12D参与CIRI中的抗炎作用进行研究,为脑缺血-再灌注损伤的临床治疗提供一定的理论基础。第一部分脑缺血-再灌注损伤大鼠脑组织中ZC3H12D和P65蛋白的表达变化[目的]观察MCAO/R（大脑中动脉闭塞/再灌注模型,Middle Cerebral Artery Occlusion/Reperfusion）损伤后的大鼠皮质神经元的形态变化,检测梗死区及脑组织中ZC3H12D和P65基因的表达变化趋势。[方法]1.建立脑缺血-再灌注损伤损伤模型:将30只雄性SD大鼠随机分为3组:对照组（control组）、假手术组（sham组）、脑缺血-再灌注损伤组（MCAO/R组）,用Zea-longa线栓法建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型,并用Zea-Longa分级评分筛选造模成功的大鼠。2.MCAO 2h/R 24h后取材,用TTC进行染色,然后观察脑组织的梗死情况。3.尼氏染色（硫堇）染色观察神经元内尼氏体数量变化。免疫荧光检测神经元凋亡及ZC3H12D表达定位的细胞类型。4.观察MCAO/R后大脑皮质ZC3H12D及P65表达变化情况。Western Blotting检测ZC3H12D及P65蛋白的相对表达量。[结果]1.大鼠MCAO/R脑缺血-再灌注损伤造模成功。MCAO/R后TTC染色可观察到右侧大脑出现明确的白色梗死灶。2.免疫荧光双标染色发现ZC3H12D与大脑皮质神经元共染。3.MCAO/R后大脑皮质神经元尼氏体减少（P=0.0022）,凋亡细胞数明显上升（P<0.0001）。4.MCAO/R大脑皮质ZC3H12D及P65表达水平明显上升（P<0.05）。[结论]1.ZC3H12D在大脑皮质神经元细胞表达。2.大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注模型造模后大脑皮质神经元数目明显减少,凋亡细胞数明显上升。3.大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注模型造模后使大脑皮质ZC3H12D及P65表达增加。第二部分ZC3H12D对氧糖缺失/复氧损伤PC12细胞炎症反应和细胞凋亡的影响[目的]探讨ZC3H12D对OGD/R（氧糖剥夺/复氧复糖模型,oxygen glucose deprivation/reoxygenation）损伤PC12细胞炎症反应和细胞凋亡的影响。[方法]1.确定OGD/R缺氧/复氧时长。通过细胞形态学观察、细胞计数、qRT-PCR检测ZC3H12D mRNA的表达确定最佳复氧时间点。2.检测慢病毒转染m/sh-ZC3H12D的效率。通过免疫荧光及Western Blotting检测转染后ZC3H12D基因的蛋白表达量判断转染是否成功。3.检测过表达ZC3H12D后细胞活力。CCK8法检测过表达ZC3H12D后细胞活力。4.检测过表达ZC3H12D对P65核蛋白的影响。通过Western Blotting检测各组ZC3H12D蛋白表达水平。5.检测过表达ZC3H12D对炎症因子的影响。通过qRT-PCR及ELISA检测炎症因子的mRNA及分子的表达水平。6.检测过表达ZC3H12D对细胞凋亡及凋亡蛋白的影响。通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,并通过Western Blotting检测抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达量。[结果]1.与Control组相较,OGD/R复氧时间3h ZC3H12D mRNA比6h表达水平差异更明显;2.CCK8检测发现慢病毒转染过表达ZC3H12D后细胞活力增加（P=0.0003）;3.过表达ZC3H12D可以降低细胞中核蛋白P65的表达量,降低炎症因子IL-1 β、IL-6、TNF-α和 NF-κB 的表达;4.过表达ZC3H12D可以降低细胞凋亡率并增加抗凋亡蛋白Bcl-2并降低凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表达量。[结论]1.过表达ZC3H12D可能通过抑制NF-κ B信号通路降低炎症因子IL-1 β、IL-6、TNF-α和NF-κB的表达,从而在氧糖剥夺/复氧复糖损伤中保护细胞;2.过表达ZC3H12D可以降低氧糖剥夺/复氧复糖模型造模后细胞凋亡率,并增加抗凋亡蛋白、抑制凋亡白蛋白的表达,说明ZC3H12D也可以通过抗凋亡的作用保护细胞。第三部分ZC3H12D通过调控NF-κB信号通路和降低炎症因子mRNA稳定性在脑缺血-再灌注损伤中发挥抗炎作用[目的]观察TNF-α刺激NF-κB信号通路对炎症因子表达的影响。观察干扰ZC3H12D对炎症因子mRNA稳定性的影响。[方法]1.TNF-α激活NF-κB信号通路后观察P65核蛋白的活化情况及入核情况:通过Western Blotting检测加入TNF-α刺激后的P65蛋白的相对量,检测NF-κB信号通路的活化情况;2.P65入核情况:通过免疫荧光检测P65和细胞核共染,进行荧光检测确定各组P65核蛋白入核情况并做对比;3.观察TNF-。激活NF-κ B信号通路后对炎症因子表达的影响:通过qRT-PCR 及 ELISA 分析各组炎症因子 IL-1 β、IL-6、TNF-α 和 NF-κB的变化情况;4.观察过表达ZC3H12D及抑制ZC3H12D表达对炎症因子mRNA稳定性的影响:通过qRT-PCR检测0h、1h、3h、6h各组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α 和 NF-κB 的 mRNA 水平。[结果]1.TNF-α激活NF-κB信号通路,并使P65核蛋白表达水平升高,过表达ZC3H12D可部分逆转TNF-α的作用（P<0.05）;2.TNF-α可以使进入细胞核的P65增多,过表达ZC3H12D可以减少入核（P<0.05）;3.与TNF-α+过表达ZC3H12D组相较,过表达ZC3H12D组炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-K B mRNA水平及蛋白水平均降低（P<0.05）;4.与干扰ZC3H12D组相较,过表达ZC3H12D随着时间逐渐明显降低炎症因子 IL-1 β、IL-6、TNF-α 和 NF-κ B mRNA 的表达水平（P<0.05）。[结论]1.过表达ZC3H12D可通过抑制NF-κ B信号通路活化降低炎症因子的表达;2.过表达ZC3H12D可通过降低炎症因子mRNA的稳定性抑制炎症反应。