食管鳞癌是发展中国家尤其是我国最常见的恶性肿瘤之一,具有高复发率和低生存率的特征。虽然随着各种治疗措施的改进使其预后有了明显提高,但截至目前为止,食管鳞癌在分子水平上的发生机制仍未彻底阐明。临床前期和临床期的诸多资料表明,食管鳞癌的早期发现对食管鳞癌患者的预后极其重要。从分子水平上阐述食管鳞癌的发生发展机制,将会有助于发现食管鳞癌治疗的潜在靶点从而提高和改善食管癌患者的生存率和预后。　　 编码多功能糖蛋白的Wnt基因家族参与调节人体各种病理生理过程,包括细胞分化、胚胎发育及肿瘤发生。而作为Wnt/β-catenin信号通路枢纽分子的β-连环蛋白(β-catenin)参与细胞内两个独立的过程,即细胞粘附和Wnt信号转导。正常情况下,大部分β-catenin与上皮钙粘蛋白(E-cadherin)粘附连接在胞膜上,只有极少部分存在于细胞质中,胞质内β-catenin水平受蛋白降解复合体所调控,使β-catenin磷酸化从而被泛素蛋白酶体系统降解。然而一旦Wnt蛋白与受体Frz结合,就可使胞质内散乱蛋白(Dsh)激活而被磷酸化,磷酸化的Dsh与APC结合抑制GSK3β活性,从而导致β-catenin不能被磷酸化。作为转录激活子的β-catenin从胞质进入胞核与核内TCF4/LEF1结合元件的启动子区结合从而激活下游靶基因如c-my、cyclin D1、survivin、c-jun等的转录和表达。　　 越来越多的证据表明,Wnt2/β-catenin信号通路的失调和紊乱与人类多种肿瘤发生密切相关。目前有关Wnt2/β-catenin通路在食管鳞癌发生发展中的作用尚未见详细报道。而抑制β-catenin的药物和单克隆抗体也已广泛地应用于治疗人类多种恶性肿瘤并取得了一定的效果。本研究中,β-catenin siRNA被用来抑制食管鳞癌细胞内β-catenin的表达,观察其对食管鳞癌细胞周期及细胞凋亡的影响,从而进一步阐述β-catenin在食管鳞癌癌变过程中可能的机制和作用。　　 硝普钠(SNP)作为一氧化氮(NO)释放剂,具有广泛的生物学活性,参与调节机体多种生理活动。研究发现,NO不仅参与与细胞增殖分化的调节,而且还可促进细胞周期的捕获和细胞凋亡。而作为心血管扩张剂应用于临床的硝普钠在肿瘤发生过程中与β-catenin之间潜在的抑制作用的机制仍有争议。尽管炎性调节因子NO和激活的β-catenin之间关系的证据不断增多,但在食管鳞癌中SNP诱导细胞凋亡是否通过降低β-catenin表达来实现尚未见报道。因此,本研究中我们同时观察硝普钠和β-catenin siRNA对食管鳞癌Eca109和EC9706细胞细胞周期和细胞凋亡的影响。　　 本研究通过检测Wnt2及其下游靶基因在食管鳞癌组织中的表达情况,分析它们与肿瘤发生部位、组织学分期、浸润深度、淋巴结转移及五年生存率之间的关系;采用半定量RT-PCR和Western blots法检测人食管鳞癌细胞中Wnt2及其下游靶基因mRNA和蛋白水平的表达情况。此外,利用新型CCK-8试剂盒检测瞬时表达硝普钠和β-catenin siRNA对Eca109和EC9706细胞增殖的影响,通过半定量RT-PCR和Western blots检测硝普钠和β-catenin siRNA处理前后的食管鳞癌细胞株中与细胞周期调控有关的基因β-catenin、c-myc和cyclin D1表达水平的变化,进一步探讨β-catenin siRNA作为潜在的肿瘤治疗靶点的分子机理。最后利用流式细胞仪检测硝普钠和β-catenin siRNA处理前后对食管鳞癌细胞细胞周期以及细胞凋亡的影响。　　 总之,本研究探讨了Wnt2/β-catenin信号通路在食管鳞癌发生发展中的作用,有助于加深人们对食管鳞癌癌变分子机制的认识和了解,为利用β-catenin作为分子靶点的肿瘤基因治疗提供了新的思路,对硝普钠与Wnt2/β-catenin信号通路的相互作用关系的研究将为今后开发出更多选择性强、高效低毒的靶向药物提供了实验依据,并最终为分子水平治疗食管鳞癌奠定了理论基础。　　 材料与方法　　 1食管鳞癌Eca109及EC9706细胞中Wnt2/β-catenin信号通路激活状态研究　　 为了探讨Wnt2/β-catenin通路在食管鳞癌Eca109及EC9706细胞中是否激活,我们采用细胞免疫化学法、RT-PCR和Western blots法检测Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1 mRNA及蛋白的表达水平。　　 2人食管鳞癌组织、癌旁组织及食管正常组织中Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclinD1的表达情况　　 40例食管鳞癌患者新鲜蜡块标本取自于2001～2006年安阳市肿瘤医院住院病人,所有患者手术前均未接受过放化疗且手术标本均无坏死肿瘤组织,每份标本中均含癌组织,癌旁组织及正常组织。临床及病理资料来自病人医学档案记录。患者年龄45～74岁(中位年龄60.95岁),其中女性18人,男性22人。肿瘤组织呈高分化6例,中分化19例,低分化15例。手术切除标本经10％甲醛固定,石蜡包埋,用于免疫组织化学分析的标本被切成4μm厚切片,其中一张用于HE染色来确定其病理组织学类型,其余切片则用于免疫组织化学分析。　　 首先将切片在二甲苯中脱蜡三次,每次5 min,然后置于梯度酒精中(梯度分别为100、90、80、70％)。为了加强抗原修复效果,切片放于微波炉中加热10 min后放入盛有枸橼酸盐的缓冲液中,高压修复20 min。为了阻断内源性过氧化物酶,每张切片在3％H2O2的甲醇中室温下放置30 min,PBS洗5 min×3次。切片和10％封闭用正常兔血清在室温下孵育20 min,4℃放置过夜后再与1:100稀释的一抗4℃过夜,然后加入生物素化二抗工作液,37℃湿盒内孵育30min,最后加入辣根酶标记的链霉卵白素工作液,37℃湿盒继续孵育10 min,将DAB底物工作液滴加在切片上,显微镜下控制显色,用自来水终止显色反应并拍照。　　 3不同浓度的硝普钠作用Eca109及EC9706细胞后对Wnt2/β-catenin信号通路的影响　　 3.1细胞增殖实验分析硝普钠对食管鳞癌细胞增殖的影响　　 采用CCK-8试剂盒检测硝普钠对食管鳞癌细胞增殖的影响。首先将不同浓度硝普钠处理的Eca109及EC9706细胞以每孔5×103个细胞的密度接种于96孔板,37℃培养24 h后每孔加入50μl用培养基稀释的不同浓度梯度硝普钠混悬液,最后加入含10％CCK-8的新鲜培养基培养4 h后用酶标仪测450 nm的吸光度。　　 3.2实时荧光定量PCR检测硝普钠对食管鳞癌细胞中Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1 mRNA的影响　　 根据操作说明采用SYBR Green法进行PCR定量检测。先用Trizol试剂提取细胞总RNA,然后采用AMV First Strand DNA Synthesis试剂盒合成cDNA第一链,PCR反应体系如下:0.5μl cDNA,0.5 U LA Taq DNA聚合酶,2.5μl10×LAPCR缓冲液,2.5 mM dNTP混合物和各50 pM正向和反向引物,Actin作为对照。PCR反应条件为:预变性95℃5 min,然后95℃40 s,不同基因采用适宜的退火温度退火40 s,72℃50 s,总共35个循环,最后72℃延伸10 min。扩增结束后,取10μl样品进行电泳检测,并用Gene Tools进行mRNA相对表达量分析。　　 3.3 Western blots分析硝普钠对食管鳞癌细胞中Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclinD1蛋白的影响　　 将不同浓度硝普钠处理后的Eca109和EC9706细胞在裂解缓冲液中进行裂解,12,000 rpm/min离心5 min收集细胞裂解产物,蛋白浓度采用Bradford法进行测定。20μg总蛋白在1×SDS缓冲液中煮5 min,通过10％SDS-PAGE电泳转移至硝酸纤维素膜上,硝酸纤维素膜先用含5％脱脂奶粉的PBST在室温下封闭2 h,然后分别加入一抗(Wnt2、β-catenin、c-myc、cyclin D1和β-actin)并用含1％脱脂奶粉的PBST进行稀释,加入羊抗(或兔抗或鼠抗)连接辣根过氧化物酶的二抗,最后用DAB进行曝光显影,并用Gene Tools进行蛋白相对表达量的分析。　　 3.4硝普钠对细胞周期的影响　　 1×106个不同浓度硝普钠处理后的Eca109及EC9706细胞培养24 h后收获并在PBS缓冲液中漂洗,然后在70％的冰乙醇中4℃固定30 min。冷PBS漂洗三次,细胞重悬于含40μg PI和100μg RNaseA的PBS溶液中,37℃孵育30 min后通过流式细胞仪分析样品中DNA的含量。　　 3.5硝普钠对细胞凋亡的影响　　 将1 mM和2 mM硝普钠处理后的Eca109及EC9706细胞培养48 h用胰蛋白酶进行预处理,PBS漂洗后,加入5μl Annexin V-FITC和2.5μl PI至100μl的细胞悬液中,并在暗室中进行混匀和孵育15 min,最后把400μl结合缓冲液加入到混合物中进行流式细胞分析。　　 4β-catenin siRNA转染食管鳞癌细胞后对β-catenin信号通路的影响　　 4.1半定量RT-PCR检测β-catenin siRNA转染后β-catenin、c-myc和cyclin D1mRNA的变化　　 根据操作说明用Trizol试剂提取总RNA,然后用AMV First Strand DNASynthesis试剂盒合成cDNA第一链。PCR扩增的反应条件为:预变性95℃5 min,然后95℃40 s,不同基因按适宜的退火温度退火40 s,72℃50 s,总共35个循环,最后在72℃延伸10 min。扩增后取10μl PCR产物进行电泳检测,并用GoneTools进行相对表达量的分析。　　 4.2 Western blots分析β-catenin siRNA转染后β-catenin、c-myc和cyclin D1蛋白的变化　　 将β-catenin siRNA处理前后的食管鳞癌细胞在裂解液中进行裂解。12,000rpm/min离心5 min后收集细胞裂解物,通过10％SDS-PAGE电泳电转至硝酸纤维素膜上,硝酸纤维素膜先用含有脱脂奶粉的PBST封闭,然后分别加一抗(Wnt2、β-catenin、C-myc、cyclin D1和β-actin),再加入鼠抗(羊抗或兔抗)连接的辣根过氧化物酶的二抗,最后用DAB进行显影曝光。　　 4.3β-catenin siRNA转染对食管鳞癌细胞周期的影响　　 1×106个β-catenin-siRNA处理后的Eca109及EC9706细胞培养24h后收获,用0.2％胰蛋白酶消化,然后在70％的冰乙醇中4℃固定30 min后过夜。上机前用冷PBS漂洗三次,细胞重悬于含有40μgPI和100μg RNase A的PBS细胞悬液中,37℃孵育30 min后通过流式细胞仪检测样品中的DNA含量。　　 4.4β-catenin siRNA转染对食管鳞癌细胞凋亡的影响　　 将β-catenin siRNA处理后的Eca109及EC9706细胞培养48h后用胰蛋白酶进行处理,并用PBS进行漂洗,将终浓度1μg/ml Annexin V-FITC和250ng PI加入到含有细胞悬浮液和结合缓冲夜的混合物中,并在暗室中进行混匀和孵育15 min,然后取400μl的结合液加入到混合物中进行流式细胞检测。　　 5统计学分析　　 RT-PCR和Western blots结果均采用Gene Tools软件进行灰度值分析,上述试验均分别重复三次。统计学处理均采用SPSS13.0统计软件,统计学数据用均数±标准差((x)±s)表示,进行单因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05表示差异具有显著性。　　 结果：　　 1 Wnt2/β-catenin信号通路在食管鳞癌组织和细胞中的异常激活　　 细胞免疫化学结果表明,食管鳞癌Eca109和EC9706细胞中Wnt2和β-catenin均呈现阳性表达。　　 半定量RT-PCR分别扩增出Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1 mRNA且人食管鳞癌EC9706细胞中Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1 mRNA的表达明显高于Eca109细胞中的表达,二者在表达量上具有显著性差异(P<0.05)。　　 Western blots法检测食管鳞癌细胞中Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1的表达情况,发现食管鳞癌细胞株EC9706细胞中Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclinD1的蛋白表达明显高于Eca109细胞,二者在表达量上具有显著性差异(P<0.05)。　　 2 Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1蛋白在食管鳞癌组织、癌旁组织和食管正常组织中的表达　　 采用免疫组织化学法检测40例人食管鳞癌组织、癌旁组织以及食管正常组织中Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1的表达情况。结果显示,Wnt2在食管鳞癌组织、癌旁组织及食管正常组织中阳性表达百分率依次为27.5％(11/40)、12.5％(5/40)和5.0％(2/40);β-catenin减弱的细胞膜表达在食管鳞癌组织、癌旁组织及食管正常组织中百分率依次为55.0％(22/40)、10.0％(4/40)和2.5％(1/40)；c-myc在食管鳞癌组织、癌旁组织及食管正常组织中阳性表达百分率依次为52.5％(21/40)、7.5％(3/40)和2.5％(1/40);cyclin D1在食管鳞癌组织、癌旁组织及食管正常组织中阳性表达百分率依次为32.5％(13/40)、7.5％(3/40)和0％(0/40),且两两组相比差异均具有统计学意义。Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1在食管正常组织、癌旁组织及食管鳞癌组织中表达水平依次升高,即随着食管鳞癌的发生发展Wnt2、β-catenin、c-myc和cyclin D1的异常表达率逐渐升高(P<0.01)。　　 β-catenin降低的膜表达和c-myc阳性表达明显地与浸润深度及淋巴结转移相关(P<0.05),而与肿瘤的分化程度及分期无相关性(P>0.05);Wnt2和cyclin D1的阳性表达率与肿瘤的分化程度及分期,浸润深度及有无淋巴结转移均无相关性(P>0.05)。　　 具有β-catenin降低膜表达(P=0.031)和c-myc阳性表达(P=0.008)患者的五年生存率明显降低提示预后较差,而Wnt2及cyclin D1阳性及阴性表达患者的五年生存率之间则无统计学差异。　　 3硝普钠对Wnt2/β-catenin信号通路作用的相关分子机制研究　　 3.1硝普钠对人食管鳞癌Eca109和EC9706细胞增殖的影响　　 用不同浓度硝普钠处理Eca109及EC9706细胞后食管鳞癌细胞的生长增殖速率明显减慢(P<0.05),而且在一定范围内抑制作用随硝普钠浓度增加而加强,结果表明,一定浓度的硝普钠能抑制食管鳞癌细胞的生长与增殖。　　 3.2硝普钠对Wnt2/β-catenin信号通路相关因子mRNA和蛋白表达的变化　　 与硝普钠处理前的Eca109及EC9706细胞相比,1 mM和2 mM硝普钠处理后的Eca109及EC9706细胞中的Wnt2和cyclinD1 mRNA的表达水平没有明显变化(P>0.05)。而同样方式处理的细胞中β-catenin和c-myc mRNA的表达水平则明显下调(P<0.05)。在三个独立的实验中,与硝普钠未处理组相比,1 mM和2 mM硝普钠处理后的Eca109及EC9706细胞中的β-catenin和c-myc的蛋白表达水平均明显下调(P<0.05),而同样方式处理的Eca109及EC9706细胞中的Wnt2和cyclinD1的蛋白表达水平均没有明显改变(P>0.05)。　　 3.3硝普钠对食管鳞癌细胞周期和细胞凋亡的影响　　 1 mM和2 mM硝普钠作用Eca109和EC9706细胞后G0/G1期的细胞百分数分别是72.4％、76.1％和76.4％、77.4％,与硝普钠未处理组相比,2 mM硝普钠作用于Eca109和EC9706细胞后S期的比率分别从16.6％上升到34.2％和从11.3％上升到12.8％,表明硝普钠激活Wnt2/β-catenin信号通路导致DNA的合成受阻。不同浓度的硝普钠作用食管鳞癌细胞后在C0/G1期细胞比率增加及在S期细胞比率降低提示硝普钠能促进细胞周期捕获。此外,1 mM和2 mM的硝普钠作用食管鳞癌Eca109和EC9706细胞后在Ⅱ期(早期凋亡期)的细胞百分数分别从7.86％上升至38.03％和从6.98％上升至26.55％。结果表明,硝普钠能激活能诱导细胞发生凋亡。　　 4β-catenin siRNA干扰食管鳞癌细胞后对β-catenin信号通路的影响　　 4.1β-catenin siRNA转染后β-catenin、c-myc和cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平的变化　　 将β-catenin siRNA分别转染细胞0 h、24 h、48 h,β-catenin siRNA转染48h后的β-catenin mRNA水平达到最低；β-catenin siRNA转染24 h后cyclin D1mRNA水平开始逐渐下降,转染48 h也达到最低。β-catenin siRNA转染前后c-myc基因的表达则无明显影响。Western blots结果显示β-catenin siRNA转染48 h后的β-catenin的蛋白水平最低；β-catenin siRNA转染24 h后cyclin D1蛋白开始逐渐下降,转染48 h后蛋白水平最低。β-catenin siRNA转染对c-myc蛋白的表达无影响。　　 4.2β-catenin siRNA转染后对细胞周期的影响　　 转染β-catenin siRNA的Eca109细胞同未转染组相比G0/C1期的细胞百分数从52.3％上升到66.5％且差异具有统计学意义(P<0.05),β-catenin siRNA转染联合硝普钠作用的Eca109细胞G0/G1期的百分数同转染β-catenin siRNA的Eca109细胞相比百分数从66.5％上升到68.2％且差异也具有统计学意义(P<0.05)；同样地,转染β-catenin siRNA的EC9706细胞同未转染组相比G0/G1期的百分数从57.1％上升到73.1％且差异具有统计学意义(P<0.05),β-cateninsiRNA转染联合硝普钠作用的EC9706细胞G0/G1期的百分数同转染β-cateninsiRNA的Eca109细胞相比百分数从73.1％上升到77.8％且差异具有统计学意义(P<0.05),提示β-catenin siRNA联合硝普钠可能会对食管鳞癌细胞株的细胞周期进程具有协同抑制作用。　　 4.3β-catenin siRNA转染后对细胞凋亡的影响　　 β-catenin siRNA转染Eca109和EC9706细胞与未转染组相比在Ⅱ期的细胞百分数分别从1.40％提高至16.88％和从0.71％提高至11.88％,差异均具有统计学意义(P<0.05)。　　 结论：　　 1.Wnt2和β-catenin在从食管正常组织、癌旁组织到食管鳞癌组织的发展过程中阳性表达率呈逐渐升高趋势,其中在食管鳞癌组织中的阳性表达率最高。提示食管鳞癌中存在Wnt2/β-catenin信号通路的异常激活。　　 2.β-catenin异常表达和c-myc阳性表达与浸润深度、淋巴结转移和五年生存率相关(P<0.05),提示β-catenin和c-myc可作为判断食管鳞癌患者预后的指标。　　 3.硝普钠能明显地下调β-catenin和c-myc的表达且诱导食管鳞癌细胞周期阻滞和细胞凋亡,提示硝普钠诱导细胞凋亡的作用可能是通过β-catenin/c-myc信号通路来实现的。　　 4.β-catenin siRNA能特异性下调食管鳞癌细胞中β-catenin和cyclin D1的表达且能诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡,提示β-catentn siRNA诱导细胞凋亡的作用可能与β-catenin/cyclin D1信号通路有关。